摘要：目的建立重组酶聚合酶扩增(RPA)技术联合毛细管电泳快速检测人腺病毒55型(HAdV55)的方法及初步应用。方法构建HAdV55-Hexon质粒作为扩增模板,针对HAdV55保守区Hexon基因序列设计RPA特异性引物,对引物筛选和优化,并建立RPA扩增及联合毛细管电泳检测体系,进行了特异性、灵敏度、可靠性评价;对18份临床样本进行RPA毛细管电泳检测。结果构建了含有HAdV55-Hexon全长基因的质粒,获得一对扩增效率最高的RPA引物;HAdV55的RPA毛细管电泳检测体系最低检出限为2.9×10^(3) copies/mL,整个过程30 min即可完成,冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1)、甲型乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒标准品提取物用该体系检测时均为阴性,且检测常见的人腺病毒类型(HAdV3、HAdV4、HAdV7、HAdV16、HAdV21)时也均为阴性,可认为对HAdV55有较强的特异性检测;建立的RPA毛细管电泳检测能够有效地检测出临床患者咽拭子中的HAdV55。结论RPA联合毛细管电泳检测HAdV55方法的建立为其临床诊断提供了良好的基础。

摘要：目的 :研究RNAi(RNAinterference)效应对HCVns5b基因表达的抑制作用 .方法 :根据HCVns5b基因序列及其二级结构特征 ,依据Tuschl等设计siRNA的原则 ,确定并合成了针对ns5b基因的siRNAs;利用电转化方法将合成的siRNAs转染NS5B EGFPHepG2细胞株 ,以未转染的细胞为对照 ;细胞爬片后经DAPI染色 ,荧光显微镜下观察和半定量RT PCR法检测siRNAs的抑制效应 .结果 :化学合成的siRNAs可以抑制HCVns5b基因的表达 ,效率可达 70 %-80 %以上 .结论 :在细胞水平上 ,化学合成的siRNAs可以抑制HCVns5b基因的表达 。

摘要：目的:从分泌抗人类天冬氨酰基β-羟化酶(HAAH)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞G3/F11中,克隆出鼠源an-ti-HAAH mAb重、轻链可变区基因,构建Anti-HAAH的单链抗体(scFv),并进行scFv基因的蛋白表达。方法:提取杂交瘤细胞G3/F11的总RNA,通过RT-PCR扩增出VH和VL基因;再利用重叠延伸PCR(SOE-PCR),通过设计在引物上的linker序列,将VH和VL拼接为完整anti-HAAHscFv基因。将测序正确的scFv基因克隆入pHEN1载体,并利用***2151进行蛋白表达;通过SDS-PAGE,Western blot分析其表达状况,ELISA鉴定其抗原结合活性。结果:测序结果显示,本实验成功地构建出鼠源anti-HAAHVH-linker-VLscFv基因,且VH、VL均具有完整正确的小鼠抗体骨架区和互补决定区结构,所得的scFv基因片段全长744bp,编码248个氨基酸。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,pHEN1-anti-HAAH在***2151可表达为Mr约27000的可溶性scFv蛋白,表达量为7.8%。间接ELISA检测显示,可溶性鼠源anti-HAAHscFv蛋白具有较高的抗原结合活性。结论:成功扩增出的鼠源anti-HAAHmAbVH区和VL区基因,并构建为anti-HAAHscFv基因。然后,利用pHEN1载体对anti-HAAHscFv基因进行成功表达,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础。

摘要：设计合成多聚合酶链反应(PCR)通用引物,结合限制性片段长度多态性(RFTL)分析,建立了腺病毒性角结膜炎的检测方法,初步应用于急性角结膜患者眼拭子标本的检测。

摘要：目的真核细胞表达丙型肝炎病毒(HCV)河北株E2蛋白胞外核心区(E2c)并利用E2c蛋白检测HCV患者血清中特异性抗E2蛋白抗体水平。方法以HCV1b型(河北株)基因序列为基础,设计HCV1b E2c基因序列并通过基因拼接的方法合成;将含有组织型纤溶酶原激活物(t PA)信号肽的E2c扩增产物克隆入p CI-neo真核表达载体,获得p CI-tpa-1b E2c载体;将p CI-tpa-1b E2c真核表达载体转染HEK293T细胞,收集细胞上清后进行浓缩及纯化,Western blot法鉴定蛋白特异性;以获得E2c蛋白为抗原,建立基于雪花莲凝集素(GNA)的改良ELISA检测HCV患者血清特异性抗E2c抗体水平。结果成功利用真核表达系统表达获得E2c蛋白,建立了GNA改良ELISA检测HCV患者血清中抗E2蛋白抗体的方法。结论成功在HEK293T细胞表达HCV-1b E2c蛋白并进行了临床应用。

摘要：目的构建2型登革病毒(DENV2)非结构蛋白3(NS3)与亲和标签融合蛋白的表达质粒,串联亲和纯化(TAP)法获得与NS3相互作用的蛋白。方法根据DENV2基因序列,设计引物;以DENV2 c DNA为模板,PCR扩增出NS3基因,经酶切后克隆至含有串联亲和标签(FLAG-StrepⅡ)的哺乳真核表达载体p CI-SF,获得重组表达质粒p CI-NS3-SF;将上述重组质粒通过转染试剂LipofectamineTM2000瞬时转染进入HEK293T细胞,Western blot法验证NS3融合蛋白的表达;通过TAP法分离纯化与NS3相互作用的蛋白。结果成功构建了NS3融合蛋白表达载体,利用TAP系统分离得到与NS3蛋白相互作用的宿主蛋白。结论串联亲和纯化法可以有效的分离与DENV2 NS3相互作用的细胞蛋白。

摘要：目的:构建HLA-G短干扰RNA表达质粒及探讨HLA-G的功能。方法:根据siRNA设计的原则,结合pSilencer2.1-U6-neo质粒的特点,针对HLA-G基因设计并合成两对寡聚DNA片段,退火后将其克隆入pSilencer2.1-U6-neo,将重组真核表达质粒pSi-lencer2.1-U6-neo-HLA-G采用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株。应用RT-PCR、W estern-blot等方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平;MTT法检测转染后JEG-3细胞增殖的变化。结果:RT-PCR和W estern-blot结果均表明瞬时转染重组pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达。实验组JEG-3细胞生长较对照组明显受到抑制。结论:pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒构建成功,可下调JEG-3细胞中HLG的表达,抑制绒癌细胞生长。

摘要：医学微生物学实验课是医学微生物学的重要组成部分,在促进基础研究与临床应用相互转化中起着重要作用。应从加强基本实验技能训练,围绕病例开展实验设计,建立开放性实验室,增加先进仪器的讲解和培训这几方面着手,让医学微生物学实验课更贴近于临床检验,使学生深入掌握检验工作的理论知识和操作要点,促进学生多方面综合素质的提高,推动医学教育事业的进步。

摘要：目的:以人类白细胞抗原G基因(HLA-G)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达。方法:针对HLA-G基因设计一段小干扰RNA(siRNA),由Ambion公司化学合成,用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR、流式细胞术和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HLA-G表达的影响。结果:针对HLA-G的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HLA-G的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HLA-G基因的表达,为进一步研究HLA-G在人类的母胎免疫耐受、正常妊娠的维持及助孕技术应用等方面的作用奠定了实验基础。

摘要：目的筛选靶向肠道病毒71型(EV71)基因组保守的5’非编码区(UTR)的有效小干扰RNA(siRNAs),确定有效靶点序列。方法设计合成靶向EV71基因组5’UTR的siRNAs;细胞毒性实验检测siRNAs对RD细胞的生存和生长的影响,显微镜观察siRNAs对EV71致细胞病变效应的影响,细胞生存实验、TaqMan实时定量RT-PCR实验筛选有效siRNAs。结果 siRNAs未影响RD细胞的生存及生长,对培养细胞无明显毒性。靶向EV71基因组5’UTR的si-1和si-2抗病毒效能最显著,能够延缓及减轻EV71感染致细胞病变效应,明显提高感染细胞的生存率,降低感染细胞中EV71 RNA的转录水平,且这种作用具有序列特异性。结论筛选出的靶向EV71基因组保守5’UTR的2个有效siRNA(ssi-1和si-2),对多株EV71中国流行株可能具有广谱抗病毒效能。