摘要：目的 PCBP1是真核细胞内的一种桥梁蛋白,具有多种生物学功能。本研究以慢病毒质粒构建PCBP1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,并筛选其稳定感染的神经细胞系,为进一步通过该载体系统探讨PCBP1的具体功能提供有力手段。方法设计合成针对人及小鼠的PCBP1基因的siRNA茎环结构的正反义序列,退火形成双链,与pLenti-Lox3.7载体的双酶切产物连接,以质粒PCR、酶切和DNA测序等方法,对重组克隆进行鉴定以确认目的片段的插入。之后,采用脂质体转染,将慢病毒载体系统的核心载体pLentiLox3.7和包装质粒共转染293T细胞,收获病毒颗粒,分别感染SH-SY5Y细胞,再通过流式分选获得感染不同病毒颗粒的细胞,提取RNA检测PCBP1 mRNA水平。结果检测结果显示PCBP1 siRNA茎环结构序列正确插入pLentiLox3.7载体,并且成功构建PCBP1基因敲低的神经细胞系。结论 PCBP1基因siRNA表达载体及其基因敲低稳定细胞系的成功构建,为进一步研究该基因在相应细胞中的功能奠定了基础。

摘要：目的抑制1型神经纤维瘤病(NF1)发病基因Nf1在人脑血管内皮细胞(HBMECs)中的表达并检测HBMECs增殖改变情况,以研究NF1相关脑血管病发病机制。方法设计并合成3对Nf1基因小干扰RNA(siRNA)及其阴性对照;使用脂质体转染法将siRNA转染进HBMECs,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)及Western blot法分别检测Nf1基因mRNA和蛋白质表达情况。将筛选出的具有最佳Nf1基因沉默效应的siRNA转染进HBMECs,并设置阴性对照,使用细胞计数试剂盒8(CCK8)法与细胞计数法检测细胞增殖情况。结果3对siRNA均具有一定的Nf1基因沉默效应,其中siRNA C基因沉默效应最佳,Nf1基因mRNA相对转录水平是对照组的(58.65±0.62)%,神经纤维瘤蛋白(neurofibromin)的相对表达量为对照组的(29.447.10)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。CCK8法与细胞计数法结果均显示Nf1基因沉默后HBMECs 5d中有4d实验组相对细胞数多于对照组(P<0.05)。结论干扰HBMECs Nf1基因后,其增殖活性增强,这可能是NF1相关脑血管病的发病机制之一。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9技术构建Nf1基因Q181X定点突变的小鼠模型,为研究该点突变与脑血管狭窄的关系提供实验工具。方法根据Nf1基因点突变的位置和基因组结构设计针对Nf1基因Q181X位点的g RNA,经活性检测后,将有活性的gRNA、Cas9 mRNA以及含有点突变序列的donor DNA通过显微注射到小鼠受精卵中,并移植至假孕鼠体内。获得F0代小鼠后,通过PCR和基因测序技术对Nf1基因进行检测和鉴定。对所获的F0代基因突变阳性小鼠继续繁育后获得F1、F2代目标基因阳性小鼠。结果成功构建Nf1-Q181X基因点突变F0代杂合型小鼠3只,F1代杂合型小鼠2只,F2代杂合小鼠6只,经PCR及基因测序鉴定可稳定遗传Nf1-Q181X点突变。结论 H通过CRISPR/Cas9技术成功获得Nf1基因Q181X点突变小鼠模型,为研究该特定点突变与脑血管异常的关系提供了实验工具。

摘要：目的前期研究中发现一合并脑血管狭窄的Ⅰ型神经纤维瘤病家系,为探索血管狭窄的病因,本研究构建该家系患者NF1基因共同突变产物NF1~180mut的过表达质粒,观察该质粒在脑血管细胞中的表达。方法设计NF1~180mut全长序列的相应引物,采用p EGFP-N1作为载体框架,构建p EGFP-N1/NF1~180mut表达载体,通过Western blot法及共聚焦检测其蛋白表达;之后采用脂质体转染重组质粒于脑血管平滑肌细胞或内皮细胞中观察NF1~180mut在两种脑血管细胞中的表达。结果(1)成功构建了NF1~180mut表达载体;(2)该表达载体可在脑血管内皮细胞及平滑肌细胞内表达;(3)初步通过细胞计数研究及增殖实验显示NF1~180mut对脑血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的生长及增殖有一定的作用。结论本研究中构建了NF1-Q181X突变后的产物NF1~180mut表达载体,为进一步深入研究NF1~180mut导致脑血管狭窄发生的通路提供了良好的体外研究工具。