摘要：本试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得整合素αV(IntegrinαV,ITGαV)及整合素β3(Integrinβ3,ITGβ3)基因敲除的猪睾丸(Swine testicle,ST)细胞系,进而在细胞水平上研究ITGαV及ITGβ3在猪δ冠状病毒(Porcine deltacorovirus,PDCoV)入侵过程中的作用及相互作用机制。根据GenBank上猪的ITGαV及ITGβ3基因序列分别设计三对引导RNA(sgRNA),并整合到LentiCRISPR‐V2载体上,与辅助质粒pSPA×2及pMD2.G共转染293 T细胞进行慢病毒包装,包装完成后感染ST细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选。用T7酶进行酶切检测,选出编辑效率较高的细胞群体,进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系。对分离出的ST‐ITGαVKO(敲除ITGαV基因的ST细胞)及ST‐ITGβ3KO(敲除ITGβ3基因的ST细胞)的单克隆细胞系进行测序和Western Blotting鉴定,结果显示ITGαV与ITGβ3均被成功敲除。采用敲除细胞系进行PDCoV感染试验,结果表明敲除ITGαV、ITGβ3基因均可抑制PDCoV在ST细胞内的增殖,成功构建的ST‐ITGαVKO及ST‐ITGβ3KO细胞系为后续阐明ITGαV、ITGβ3在PDCoV入侵过程中的作用提供了细胞模型。

摘要：猪星状病毒(porcine astrovirus,PAstV)属于星状病毒科,是哺乳动物星状病毒属家族成员,临床上主要引起仔猪呕吐、腹泻等症状,且常与其他病原混合感染。PAstV衣壳蛋白(capsid protein,Cap)与宿主细胞受体结合,诱导机体产生中和抗体,是开发PAstV疫苗的靶蛋白。为制备抗猪星状病毒5型衣壳蛋白的兔源多克隆抗体,本研究通过DNA Star软件对PAstV5 Cap进行抗原性分析,选择出抗原优势区域ORF2开放阅读框1~642 bp(642 bp),构建原核表达质粒pET32a-Cap-642,测序结果正确后将其转化至大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为43 ku。重组蛋白经尿素透析法纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。间接ELISA方法测定多克隆抗体效价为1∶51 200,间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)结果显示抗PAstV5 Cap多克隆抗体能够特异性地识别PAstV5感染猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK1)中表达的天然抗原;同时将抗PAstV5 Cap多克隆抗体进行了初步应用,结果表明该多抗具有良好反应性。本研究为PAstV5检测方法的建立以及PAstV5衣壳蛋白功能的研究奠定了基础。

摘要：根据Gen Bank上发表的PPV的基因组序列,设计扩增非结构蛋白NS1基因的特异性引物。通过PCR方法克隆NS1基因,经双酶切及与pEGFP-N1载体连接构建了真核表达载体pEGFP-N1-NS1,将双酶切和测序鉴定正确的质粒转染至293T细胞,经过荧光观察和PCR方法鉴定。结果表明,克隆了猪细小病毒NS1基因的全序列1989 bp,成功构建了NS1基因的真核表达载体,并在293T细胞中转染表达。

摘要：为了探究猪细小病毒NS1蛋白入核机制,通过生物信息学网站预测PPV NS1核定位序列,根据GenBank上传的PPV非结构蛋白NS1的序列设计NS1扩增引物和一系列重叠PCR引物,以河南省动物性食品安全重点实验室保存的猪细小病毒DNA为模板,扩增NS1和缺失突变体基因,构建真核表达重组质粒pCAGGS-HA-NS1、pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel。将其转染至PPV易感猪源细胞系PK-15细胞,通过免疫荧光和Western-blot鉴定NS1和不同的NS1缺失突变体在细胞内的核定位情况。结果表明,pCAGGS-HA-NS1、pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel编码蛋白均成功表达。免疫荧光和Western-blot显示NS1和NS1207-267aaDel蛋白定位于细胞核,而NS165-133aaDel蛋白的细胞定位较NS1发生改变,由细胞核定位改变为细胞质定位,说明PPV NS1蛋白65-133位氨基酸缺失能改变其在细胞内的核定位,PPV NS1蛋白核定位序列NLS存在于NS1的65-133aa处。