摘要：【目的】为建立精准、高效的多重微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量分析检测方法,开发可同时鉴别新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因的检测体系,提高病毒性传染疾病的诊断效率及传播风险监测能力。【方法】通过筛选保守基因序列并设计特异性引物与探针,优化反应体系和扩增程序,对该方法的特异性、灵敏度及稳定性进行评价。以临床样本为实验材料,利用建立的ddPCR方法进行检测和验证,确定阳性检出率。【结果】多重ddPCR反应体系中,各对引物探针对目的片段均能有效扩增,SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因灵敏度检测下限分别为0.59、0.68、1.44、1.03 copies/μL。在20份临床样本的核酸检测中,共检出16份阳性样本,阳性率达80%(16/20),经荧光定量PCR方法复测符合率一致。【结论】研究建立的多重ddPCR方法特异性强、灵敏度高,可实现对临床样本中微量新冠病毒的精确定量检测。

摘要：为了能对大熊猫轮状病毒的早期感染和隐性感染做出有效诊断,并为病毒定量分析提供技术支持。本研究根据Gen Bank中登录的大熊猫轮状病毒(GPRV)VP4基因序列设计1对引物,建立一种快速准确的检测大熊猫轮状病毒的荧光定量RT-PCR方法,并对引物浓度、退火温度和循环数进行优化,同时建立标准曲线,并将建立的荧光定量方法与常规RT-PCR方法比较。结果显示,本试验建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高出至少100倍。特异性和重复性检测结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的重复性。研究结果表明该方法可以对大熊猫轮状病毒进行稳定、可靠的检测,可以满足大熊猫轮状病毒特性研究和感染诊断的需要。

摘要：根据GenBank上登录的鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)ORF6基因序列(登录号:JQ815364.1)用Primer Express 3.0设计并合成ORF6基因特异性引物及Taq Man探针,建立了检测鲤疱疹病毒2型的微滴式数字PCR(dd PCR)方法。结果显示,dd PCR的检测灵敏度比qPCR高5倍。特异性和重复性检测结果表明,ddPCR和qPCR均具有良好的特异性和较高的重复性。qPCR和dd PCR标准曲线的r2值分别为0.999 2和0.997 5,表明ddPCR和qPCR均具有良好的线性关系。研究结果表明,该方法可以对CyHV-2进行可靠的检测,可以满足CyHV-2特性研究和感染诊断的需要。对60份临床样品的检测结果显示,在检出阳性的34份样品中,包含肾、脾、腮、肝、心和脑,表明该病毒在这些器官均有分布,其中肾的病毒含量相对最高,脑的病毒含量相对最低。总之,本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强、能快速检测到极低含量的病毒,适用于CyHV-2的快速检测和病原流行病学调查。

摘要：本试验旨在研究不同木聚糖水平饲粮中添加木聚糖酶对断奶仔猪生长性能、肠道微生物代谢产物和菌群数量的影响。选择30头体重相近,遗传背景相似的28日龄＂杜×长×大＂三元杂交断奶阉公猪,采用2×3因子试验设计,设2个饲粮木聚糖酶添加量（0和1 000U/kg）和3个饲粮木聚糖水平（4.58%、6.23%和7.54%）,将仔猪随机分为6个处理,每个处理5个重复,每个重复1头猪,试验期14d。结果表明：试验1~14d,添加木聚糖酶能显著提高仔猪平均日增重（P〈0.05）;添加木聚糖酶趋于提高回肠内容物乙酸含量（P〉0.05）,显著提高总挥发性脂肪酸含量（P〈0.05）,显著降低盲肠内容物氨含量（P〈0.05）,显著增加盲肠内容物双歧杆菌数量（P〈0.05）,且以上各项指标均以饲粮木聚糖水平为7.54%时,木聚糖酶的添加效果最为明显。但饲粮木聚糖水平对于以上指标均无显著影响（P〉0.05）。综上所述,在本试验条件下,添加木聚糖酶可以提高断奶仔猪生长性能,并在一定程度上改善肠道微生态环境,且木聚糖酶的作用效果与饲粮木聚糖水平存在着剂量依赖关系。

摘要：目的:对植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因进行克隆并表达,并测定酶的活力。方法:根据Gen Bank中亚硝酸盐还原酶(NIR)基因序列,设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增nir基因,TA克隆构建获得重组质粒p MD19-nir,分析其核苷酸序列同源性。通过双酶切连接到表达载体p ET-32a(+)中,获得重组表达载体p ET-32a-nir,构建成功后转化到*** BL(DE3)中进行表达研究。经IPTG诱导表达,得重组蛋白,超声波破碎,提取粗酶液,测定酶活力。结果:克隆的目的基因序列长度为1638 bp。获得重组蛋白分子量为80 ku,酶活力为4.2 U/mg。结论:成功克隆了植物乳杆菌中的亚硝酸盐还原酶基因,成功的导入到*** BL(DE3)中,表达产物有酶活。

摘要：针对加工肉制品中DNA提取难度大、干扰杂质多、难以实现自动化、不能满足高通量的核酸检测需求等问题,研究建立了一种适用于加工肉制品的高通量、自动化的DNA提取方法。该方法采用实验室设计优化磁珠并对体系关键组分进行优化,考察了方法适用性和重复性,与国内外典型厂商的5种试剂盒比对,再联合8家实验室验证了其对39种加工肉制品的提取效果。结果表明,此方法提取的加工肉制品DNA浓度高、纯度好,适用于动物组织及加工肉制品手动和自动化提取,实际样品检出率为100%。该方法重复性好,适用于不同种类动物组织及加工肉制品自动化、高通量的DNA提取,产物满足荧光定量PCR检测、二代测序等下游试验要求,为食品掺假的分子鉴别提供技术支撑。

摘要：本研究旨在观察饲粮中添加苏氨酸对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)诱导的免疫应激仔猪生长性能和肠道健康的影响。试验选用30头平均体重为(6.94±1.26)kg健康的"杜×长×大"断奶仔猪,采用3×2因子试验设计,饲粮中真可消化苏氨酸水平为0.74%、0.89%和1.11%;仔猪接受免疫应激(注射PRV弱毒苗)或不应激(注射灭菌生理盐水)处理。免疫应激仔猪于试验第8天早上注射PRV弱毒疫苗。试验期为21 d。结果表明:PRV的注射极显著提高了试验第21天血清PRV特异性抗体水平(P<0.01),表明PRV疫苗攻毒诱导免疫应激模型构建成功。PRV诱导的免疫应激有提高仔猪7～21 d的料重比的趋势(P<0.10),且显著提高了1～21 d的料重比(P<0.05),极显著提高了空肠隐窝深度(P<0.01),极显著降低了空肠绒毛高度/隐窝深度(P<0.01),并引起十二指肠黏膜变性坏死脱落等形态学病变。饲粮添加苏氨酸能在一定程度上影响仔猪7～21 d和1～21 d的料重比(P<0.10),并有提高仔猪十二指肠绒毛高度的趋势(P<0.10),对十二指肠绒毛高度/隐窝深度的影响与PRV诱导的免疫应激存在显著的互作效应(P<0.05),且能够缓解PRV诱导的免疫应激产生的肠道形态学病变。由以上的试验结果可知,饲粮添加苏氨酸能在一定程度上减缓PRV诱导的免疫应激带来的断奶仔猪生长性能下降和肠道损伤。

摘要：本试验旨在研究饲粮消化能水平和可消化赖氨酸与消化能比值对长白×荣昌(长荣)杂交生长猪生长性能及胴体品质的影响。试验选用144头初始体重约为27.05 kg的健康长荣杂交猪,按体重相近、公母各占1/2的原则随机分为6个处理,每个处理6个重复,每个重复4头猪。采用2×3因子设计,即饲粮消化能水平分别为13.00和14.50 MJ/kg,饲粮可消化赖氨酸与消化能比值分别为0.50、0.60和0.70 g/MJ。分别测定生长猪的生长性能、胴体性状、肉品质和血清生化指标。结果表明:饲粮消化能水平升高,显著提高生长猪平均日增重、胴体重、屠宰率和血清尿素氮含量(P<0.05),显著降低平均日采食量、料重比和滴水损失(P<0.05),且有提高血清低密度脂蛋白胆固醇含量(P=0.07)及降低血清甘油三酯含量(P=0.06)的趋势。随着饲粮可消化赖氨酸与消化能比值的增加,生长猪眼肌面积、血清尿素氮和高密度脂蛋白胆固醇含量显著增加(P<0.05),肌内脂肪含量显著降低(P<0.05),且料重比有提高的趋势(P=0.05),平均背膘厚呈降低的趋势(P=0.09)。饲粮消化能水平和可消化赖氨酸与消化能比值对生长猪胴体瘦肉率、血清尿素氮、肌肉pH45 min和pH24 h的影响存在显著交互效应(P<0.05)。以上结果表明,在保持氨基酸模式一致条件下,饲粮消化能和可消化赖氨酸水平对长荣生长猪的生长性能和胴体品质影响显著,综合评定可知,生长阶段的长荣猪最佳生长潜能和最优胴体品质所需的饲粮消化能和可消化赖氨酸水平分别为14.50 MJ/kg和0.73%。

摘要：为了建立牦牛肉源性检测的实时荧光PCR方法,本研究基于比较牦牛与黄牛、鸡、猪、羊、鸭等动物的Cytb基因序列差异,设计其特异性引物。特异性实验结果表明,猪肉、鸡肉和黄牛肉的DNA均不与引物发生交叉反应;灵敏度实验表明方法的最低检出限可达0.004 ng/μL;抗干扰实验结果表明,当牦牛肉的添加量为1%时仍可检出;对市场上的20份不同种肉样进行检测,除牦牛肉样品检测结果呈现阳性外,其余肉样均为阴性。本实验所建立的实时荧光PCR方法为牦牛源性成分鉴别提供一种快速、准确、专属性强的检测方法。

摘要：根据已测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株序列设计1对引物,应用PCR方法从重组质粒PMD-ORF5扩增得到缺失信号肽序列的基因片段dORF5,将dORF5克隆至原核表达载体PBAD/Myc-His B上,成功地构建了重组表达质粒PBAD/Myc-His B-dORF5,转化大肠埃希菌TOP10感受态细胞,经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE可检测到分子质量约为19.4 ku的目的蛋白,经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达17.1%。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,这为进一步研究GP5蛋白的结构、功能和开发新型诊断试剂盒、新型疫苗提供了理论与物质基础。