摘要：目的 :检测RhoC在胃癌细胞系中的表达 ,并构建其小干扰RNA(siRNA)表达载体。方法 :以Westernblot方法检测RhoC在多株胃癌细胞系中的表达。利用计算机辅助设计RhoC特异性siRNA ,体外合成siRNA基因并将其定向克隆入真核表达载体mU6pro。以脂质体法转染RhoC siRNA载体至高转移的人胃癌细胞系AGS中 ,以Westernblot方法鉴定RhoC siRNA对RhoC表达的作用。结果 :RhoC蛋白在具有高转移潜能的胃癌细胞系中表达增强。利用BbsⅠ和XbaⅠ双酶切法鉴定重组载体后 ,DNA测序证实合成的siRNA基因序列正确并已被准确克隆入mU6pro载体。RhoC siRNA载体可特异性抑制AGS细胞中RhoC的表达。结论 :RhoC特异性siRNA表达载体成功构建 。

摘要：目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpinRNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducibleFactor-1,HIF1)基因的沉默效果。方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1。以人HIF1cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1。新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变。结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义。

摘要：目的构建TSG101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)小干扰RNA(TSG101 siRNA)的真核表达载体并鉴定,初步研究其与胃癌多药耐药的相关性。方法根据小干扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列,应用DNA重组技术将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体;将TSG101 siRNA的真核表达载体转染胃癌长春新碱(VCR)耐药细胞SGC7901/VCR,通过Western blot鉴定TSG101 siRNA的抑制效率;以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素(ADM)的药物敏感性。结果所构建的载体经酶切后释放出预期大小的片断并经测序证实;TSG101 siRNA真核表达载体瞬时转染胃癌耐药细胞SGC7901/VCR后,发现TSG101的表达被显著抑制;细胞生长减慢,且对VCR、ADR的敏感性增加。结论成功构建了TSG101 siRNA的真核表达载体,并初步提示其参与了胃癌的多药耐药,为下一步工作奠定了基础。