摘要：目的 构建无标记的clpP基因缺陷的变异链球菌（简称变链菌）突变株.方法 设计引物PCR扩增大观霉素（Sp）抗性基因,使loxP位点位于Sp抗性基因的两侧,构建出大观霉素抗性基因盒（loxP-Sp-loxP）.将clpP基因克隆到pGEM-T-Easy TA载体后,双酶切以去除clpP基因的部分序列,并连入loxP-Sp-loxP,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pIB△clpP-Sp.将该载体线性化并电转变链菌标准株,大观霉素筛选得到clpP基因缺陷株.再以温敏质粒pCrePA电转缺陷株,Cre重组酶表达并删除选择标记基因,继而在限制性温度下培养以消除pCrePA,获得无标记的clpP基因缺陷株,并进行PCR及DNA测序鉴定.结果 PCR及DNA测序结果表明clpP基因内部分序列已被删除,且无Sp抗性基因,该部位只留有一个34 bp的loxP位点.结论 在变链菌中成功构建出无标记的clpP基因缺陷株,为进一步研究clpP基因的功能及其在变链菌致龋过程中的作用奠定了基础.

摘要：目的:探讨前列腺特异性膜抗原增强子、启动子(PSMAe/p)驱动shRNA转录效果,比较何种终止序列最有效。方法:分别以poly(A),minipoly(A),poly(U)为终止序列设计针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的干扰序列,克隆入经SalⅠ和BamHⅠ双酶切的pPSMAe/p载体上。然后通过脂质体介导,将各重组干扰质粒与pEGFP-C1质粒共转染PC-3和LNCaP细胞,采用荧光显微镜,流式细胞仪,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测EGFP在各组细胞中的干扰效果。结果:重组质粒中成功插入了目的基因片段;荧光显微镜和流式测定结果显示各干扰质粒与pEGFP-C1质粒共转染LNCaP后,各干扰组荧光表达均有不同程度减少,与空载体组相比均有统计学差异(P0.05),EGFP mRNA和蛋白表达水平无明显差异;LNCaP细胞各干扰组中EGFP mRNA和蛋白表达与空载体对照组相比均有不同程度下降,以pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)组最为明显。结论:成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)、pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)和pPSMAe/p-shEGFP-poly(U);PSMAe/p可特异性驱动shRNA转录;poly(A)终止信号终止转录最有效。