摘要：根据羊口疮病毒(OrfV)的B2L基因设计4条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物和1条异硫氰酸荧光素标记的DNA探针,再利用横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物。通过对各反应条件包括反应温度、反应时间、内外引物浓度比、Bst DNA 2.0聚合酶浓度、dNTP Mix浓度、Mg^(2+)浓度以及探针结合温度等优化后,建立了检测OrfV的LAMP-LFD方法。结果显示,LAMP-LFD可特异性检测OrfV,而山羊痘病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒及丝状支原体山羊亚种等均未检出;LAMP-LFD对OrfV-B2L质粒DNA最低检测浓度为4.95×10^(-2)拷贝/μL,其灵敏度是以外引物建立PCR方法的1000倍。利用PCR和LAMP-LFD检测29份临床样品,两者检出符合率为100%。研究建立的LAMP-LFD检测方法可快速、特异地检测OrfV,可作为早期诊断和检测OrfV的有效手段。

摘要：根据鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestfer,RA)ompA基因设计4条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物和1条带有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的DNA探针,利用横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物。通过对反应条件包括温度、时间、内、外引物浓度比、Bst DNA 2.0聚合酶浓度、dNTPs浓度及Mg^(2+)浓度等优化后,建立了RA的LAMP-LFD检测方法。结果显示:在64℃下运用LAMP扩增核酸到结果判读只需33 min;LAMP-LFD可特异性检测鸭疫里默杆菌,巴氏杆菌核酸、大肠杆菌核酸、沙门菌核酸、葡萄球菌核酸、鸭瘟病毒均未检测出;LAMP-LFD对pMD19-T-ompA最低检测浓度为1.83×10^(0)copies/μL,其敏感度是PCR的1000倍。利用PCR和LAMP-LFD检测22份疑似RA临床样本,两者检出符合率为100%。研究建立的LAMP-LFD检测方法能快速、特异地检测RA,可作为早期诊断和检测RA的有效手段。

摘要：为建立一种能同时检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的三重PCR方法,试验首先根据GenBank中的兔穿孔艾美耳球虫Eper基因、黄艾美耳球虫Efla基因、大型艾美耳球虫Eman基因序列设计3对特异性引物,通过优化PCR反应的退火温度和引物浓度,建立一种用于检测兔肠道球虫病的三重PCR方法,然后对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评价,最后分别采用该方法及单一PCR方法对82份临床样本进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:所建立的三重PCR方法的最佳退火温度为59.7℃,最佳引物(F/R)浓度为0.15/0.15,0.20/0.20,0.20/0.20μmol/L(Eper、Efla、Eman基因);该方法能特异性扩增出兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊靶基因,而斯氏艾美耳球虫、大肠杆菌及沙门氏菌的检测结果为阴性;能够检测出穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊基因组DNA的最低限值分别为6.0,6.4,8.0 pg,两种模板浓度组合(60,64,80 ng/μL和6.0,6.4,8.0 ng/μL)批内重复性试验和批间重复性试验所有重复均扩增出预期目的条带;临床样本中,该方法的单一球虫检出率为53.6%,两种球虫检出率为30.5%,三种球虫检出率为7.3%;除黄艾美耳球虫+大型艾美耳球虫的混合感染类型两种方法检测结果的符合率为91.8%外,其他感染类型两种方法检测结果的符合率均为100%,整体符合率为98.8%。说明成功建立了一种可用于检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的多重PCR方法,该方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点。

摘要：为了构建羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)B2L-F1L截短融合基因,并对该基因序列进行生物信息学分析,试验采用DNAStar生物信息学软件分别对B2L、F1L基因序列进行分析,截取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域,分别设计引物,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对截取的B2L、F1L基因主要抗原区域进行融合,并与pMD-18T载体连接,构建重组质粒pMD18-T-B2L-F1L,经PCR鉴定、双酶切和测序验证正确后,应用生物信息学在线软件对B2L-F1L截短基因编码的蛋白质进行信号肽、跨膜结构、亲疏水性、柔韧性、抗原指数、抗原决定簇、糖基化结合位点、磷酸化结合位点、二级结构和三级结构进行预测。结果表明:构建的B2L-F1L截短融合基因大小约为1080 bp,与预期目的片段大小相符;该蛋白有信号肽、无跨膜结构域,亲水性、抗原指数及柔韧性较好,有17个抗原决定簇,2个糖基化结合位点和28个磷酸化结合位点,二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲占比较大。说明试验成功构建出羊口疮病毒B2L-F1L截短融合基因。