摘要：目的建立敲除基因组中PDE10A基因的CRISPR/Cas9系统。方法设计3个长20bp的sgRNA,分别靶向PDE10A的exon 6、exon 7和exon 11。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,并克隆进PX330质粒中。将克隆正确的质粒PX330-sgRNA转染至HEK293T细胞中,提取基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,再通过SURVEYOR分析和一代测序对敲除效率进行检测。最后采用有限稀释法挑选稳定敲除PDE10A的HEK 293T细胞株。结果目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入PX330质粒中且序列正确;靶向Exon 7的sgRNA可成功敲除PDE10A,且敲除效率高达31.4%;稳定敲除PDE10A的细胞株筛选成功,可导致2 bp缺失。结论PDE10A基因CRISPR/Cas9敲除系统构建成功。

摘要：目的探索基于去活化CasMINI蛋白(dCasMINI)的CRISPR干扰(CRISPRi)工具设计及其转录抑制效果评估。方法采用四环素诱导基因开启系统(tet-on),流式细胞测量术和实时荧光定量反转录聚合酶链反应从质粒基因、基因组外源性基因位点和内源性基因位点三个层次评估dCasMINI系统在哺乳动物细胞中的转录抑制效果,并进一步设计和比较6种dCasMINI-CRISPRi工具(dCasMINI、dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB、dCasMINI-3x KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2)和不同位置单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)的转录抑制效果。结果dCasMINI、dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB、dCasMINI-3x KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2能够不同程度地抑制质粒基因、基因组外源性基因的转录(P<0.05);dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2能够不同程度地抑制内源性基因的转录(P<0.05);不同结合位点的sgRNA具有不同的转录抑制效果(P<0.05)。结论CasMINI系统能够改造成多种CRISPRi工具进行基因敲降研究,未来有望应用在多个场景,如原代细胞表观基因编辑、体内筛选和临床治疗等。