摘要：目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行分子建模及三维结构观察,并构建了原核表达质粒,进行嵌合基因的表达、纯化,为进一步利用其酶学活性建立抑制分子筛选系统奠定基础。方法运用Bioedit和DNAStar软件对MRSA耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段序列和活性区结构特点及其活性发挥进行分析,设计TG-TPase嵌合药靶,并通过引物设计从MRSA菌株中克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP基因片段,进一步用引物延伸法、酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因并亚克隆至原核表达质粒pET30b中,转化Rosetta(DE3)plysS大肠埃希菌,用IPTG进行诱导表达,并小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化和Western blotting鉴定。结果设计的TG-TPase嵌合药靶包括PBP2分子的TGase活性区、绞链区的N-端,PBP2a分子绞链区C-端及完整的TPase结构域,融合基因为1 935 bp,编码645个氨基酸,等电点为7.10,相对分子质量72 000。用PCR法从MRSA菌株中成功克隆了青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达出药靶蛋白,表达结果与预期设计相符合。融合蛋白纯化分析表明,融合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上。结论成功设计、构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,并对融合蛋白进行了初步纯化,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。

摘要：高温变性是实验室常用的方法，如用煮沸法提取质粒DNA，用煮沸法变性DNA检测样品或DNA双链探针，以及在PCR中使用94 ℃变性模板等。这给我们留下一个强烈印象：即核苷酸链是耐高温以至可以接受煮沸处理的。基于这一事实，最近我们使用煮沸法来灭菌欲无菌保存的DNA样品，结果意外发现100 ℃加温处理可以不同程度地损害DNA分子，引起了我们对高温变性处理双链DNA分子的高度重视，特设计实验观察高温对DNA的损害的程度以及高温对不同来源DNA的损害是否有差异。现将结果报告如下。

摘要：目的　通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB β ,为大量制备hPAB β奠定基础。 方法　根据肽抗生素的特性 ,确立 4条设计原则 ,并据此设计一 489bp的承载蛋白编码序列 ,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE 3 2中构建成表达载体 ,进一步将肽抗生素hPAB β基因插入上述表达载体 ,肽抗生素基因位于承载蛋白编码序列 3’ 端 ,两者构成融合基因。将含融合基因的表达载体转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子 ,并用阳性重组子表达融合蛋白。结果　设计的承载蛋白为 163个氨基酸 ,分子量 17668.80 ,等电点 5 .62 1。用承载分子与肽抗生素hPAB β构建的融合蛋白表达载体转化细菌后 ,筛选到 4个阳性重组子 ,均能高效表达肽抗生素融合蛋白 ,融合蛋白的产量占细菌总蛋白的 40 %～ 45 %。结论　设计的承载蛋白分子能够实现肽抗生素的高效表达。

摘要：目的:克隆表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因并检测其活性.方法:应用PCR技术从铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组中扩增多糖解聚酶基因,将其克隆于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;采用Ni-NTA柱亲和层析分离纯化目的蛋白;提取铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖,观察目的蛋白对胞外多糖的降解活性.结果:采用PCR技术成功扩增了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因,所构建的重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化***109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为20.4×103,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要在上清中以可溶形式表达.经Ni-NTA柱亲和层析后蛋白纯度大于95%.初步活性检测结果表明重组PaP3多糖解聚酶蛋白对生物膜胞外多糖具有一定的降解作用.结论:重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌的胞外多糖,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.

摘要：目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A（PE），为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因，将其克隆于原核表达载体pQE-31中，所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109，IPTG诱导表达；制备融合蛋白包涵体，并采用Ni—NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白；采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性，MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化，扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致；转化*** JM109后，IFTG诱导目的蛋白表达率约为25％；SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（Mr）约为66×10^3，与理论预期值一致；破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95％。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度（IC50值）分别为2．13μg/ml、2．58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化，获得了具有细胞毒活性的重组PE，为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。

摘要：目的设计、构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行原核表达、纯化探索,为进一步利用其酶学活性建立抑制剂筛选系统奠定基础。方法通过引物设计,从盐平板法筛选的MRSA菌株中分别克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP片段,分别克隆入T载体,对阳性重组子进行酶切/再连接,构建TG-TPase嵌合基因,经核苷酸测序鉴定正确的嵌合基因再亚克隆到pET22b,构建表达载体,转化Rosetta(DE3)plysS,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行SDS-PAGE、质谱和Western blotting鉴定。小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化。结果从13株临床分离的金葡菌中筛选出2株高耐药性MRSA菌株,用PCR法从中成功地克隆到青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达载体,并在大肠埃希菌中表达,产量达菌体总蛋白的43%。融合蛋白纯化分析表明,嵌合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上。结论成功设计并构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。

摘要：确定人工合成的人肽抗生素hPAB β的抗菌活性。利用已知肽抗生素hBD 2的晶体结构坐标进行hPAB β的同源模建 ;设计hPAB β突变体 ;用PCR法生成hPAB β突变体基因 ,分别构建转移载体和重组杆状病毒。结果表明 ,合成肽hPAB β在正确复性后具有较好的杀菌活性 ,将 4种突变体基因插入转移载体pFASTHTa ,筛选阳性重组子pFAST hPAB β并转化DH10Bac大肠杆菌 ,获得了重组杆状病毒 ,为筛选活性强而结构更为简单的hPAB

摘要：目的　用两对引物对临床标本中肺炎衣原体进行检测 ,对阳性PCR产物部分序列进行测定和同源性分析 ,探讨肺炎衣原体的基因分型。方法　用根据肺炎衣原体 16srRNA及种特异性 5 3kDa蛋白抗原基因序列设计的两对引物Cpnl～Cpn2 ,5 3A～ 5 3B对 1994年 5月～ 1999年 3月间采集的有呼吸道疾患病人的鼻咽拭子标本 182份进行PCR检测 ,从阳性标本中随意挑取 13 6和 14 4号标本 ,纯化PCR产物 ,进行核苷酸测序 ,并将测序结果与已报道的肺炎衣原体分离株进行同源性比较分析。结果　标准AR - 3 9株及 2 1例标本均扩增得到约 4 60nts的 16srRNA基因片段 ,2 5例标本扩增得约 83 0nts的5 3kDa蛋白基因核酸片段。对 13 6、14 4号标本的PCR产物测序结果显示 ,2 4 4nts的 16srRNA基因序列完全相同 ,且与标准肺炎衣原体AR - 3 9、TW 183、IOL2 0 7及CWL0 2 9的对应序列 10 0 %同源 ,而与马肺炎衣原体分离株N16相比较有 3处突变 ,与非洲热带蟾蜍分离株CPXT1比较有 3处突变 ,与小鼠肺炎衣原体分离株J13 8相比有一处不同 ,表明人的肺炎衣原体株 16rRNA基因较为保守 ,与动物分离株有差异 ;标本 14 5nts的 5 3kDa蛋白基因也 10 0 %同源 ,该序列与从人体分离的AR - 3 9株以及从小鼠分离的J13 8株序列完全一致 ,表明肺炎衣原体 5

摘要：目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,构建其真核表达质粒,为嵌合基因的高效、分泌型表达奠定基础。方法在序列结构分析的基础上,设计引物从MRSA菌株中扩增其耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段,进一步用酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因,亚克隆至酵母表达质粒pPIC9K中,转化DH5α大肠埃希菌。经酶切、PCR和核苷酸测序鉴定正确的重组质粒用SalⅠ线性化,整合入甲醇营养型毕赤酵母GS115中,在DNA和基因转录水平鉴定出阳性重组酵母。结果采用PCR从MRSA基因组中扩增得到了873bp的TGase片段和1044bp的TPase片段。以酶切连接构建的TG-TPase嵌合基因经酶切、PCR鉴定,能获得约1900bp的融合片段,与预期结果相符,测序表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转化GS115后,得到5个高拷贝阳性转化子,经诱导表达和PCR鉴定,这些转化子能转录出目的基因的mRNA。结论成功构建了含TG-TPase嵌合基因的重组毕赤酵母工程菌,为进一步高效制备嵌合蛋白、进而利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选创造前提。

摘要：阐述临床医学8年制专业开设生物信息学课程的必要性，论述教学实施过程中教材选择、教学内容安排、教学方法设计以及考核方法创新等方面的措施和经验，为该专业生物信息学课程建设提供参考。