摘要：为了快速鉴定小鼠的性别,试验根据GenBank及参考文献针对小鼠设计了2对引物IL3-1、IL3-2和SRY-1、SRY-2进行多重PCR,对15日龄小鼠胚胎进行了性别鉴定。结果表明:雄性样品扩增出了544 bp和402 bp 2条片段,而雌性样品只能扩增出1条544 bp的片段。

摘要：目的构建去乙酰化酶SIRT1基因敲除的K562单克隆细胞株,研究SIRT1基因对细胞增殖的影响。方法设计靶向SIRT1酶活性中的sgRNA编码序列,构建CRISPR/Cas9载体并转染K562细胞,嘌呤霉素筛选后单克隆化并扩增;采用基因组测序、PCR和免疫印迹的方法进行基因敲除效果鉴定;对选定的SIRT1基因敲除的单克隆做生长曲线检测。结果目标质粒测序符合,质粒转染细胞后检测到基因组靶序列位置杂合峰,获得SIRT1基因敲除的单克隆3个,SIRT1基因敲除导致细胞增殖明显减缓。结论成功构建了SIRT1基因敲除的细胞株,该细胞可作为血液系统疾病研究的有力工具。

摘要：目的:构建心脏阿霉素反应蛋白(CARP)基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素(ADR)心肌病中的作用及机制奠定基础。方法:将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA(shRNA)序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果:基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍(P=0.01),shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%(P=0.02)。结论:成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。

摘要：目的构建含糖尿病相关锚定重复序列蛋白(DARP)基因的重组腺病毒过表达及RNA干扰载体。方法应用PCR技术扩增大鼠DARP基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入表达载体GV-314和GV-119,经基因测序鉴定。用重组DARP过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGloxΔE1共转染人胚肾细胞HEK293,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。用重组腺病毒感染大鼠H9c2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western Blot检测DARP蛋白表达。结果基因测序显示DARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293细胞包装成功。DARP过表达和shRNA腺病毒明显影响H9c2细胞中DARP蛋白表达水平。结论成功构建了大鼠DARP过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体。