摘要：小鼠miR-499基因包含在心肌重链肌球蛋白Myh7b基因的第19内含子中,并且在心肌细胞中特异表达,然而其在心肌细胞中表达的生物学功能和意义尚不清楚.利用可体外分化为心肌细胞的P19CL6细胞建立稳定表达miR-499的细胞株对研究miR-499的生物学功能具有重要意义.根据小鼠miR-499基因序列,设计PCR引物并将扩增产物定向克隆到pcDNA3.1中构建为真核表达载体并转染小鼠P19CL6细胞,经G418筛选建立了稳定转染的P19CL6-miR-499细胞株.用TaqMan探针实时定量PCR检测表明,P19CL6-miR-499细胞可成功表达成熟的miR-499.经1%DMSO诱导分化,RT-PCR、real-time PCR和激光共聚焦显微镜免疫荧光分析,结果表明,稳定转染miR-499对细胞分化早期的分子标志Isl1和Tbx5的表达没有明显影响,但是对分化晚期的特异性分子心肌α-肌动蛋白(α-cardiac actin)和心肌肌钙蛋白(troponin I)的表达有明显抑制作用,这提示miR-499主要对心肌细胞分化晚期有影响.

摘要：背景：Ⅰ型及Ⅲ型胶原含量与比例的变化是促使心脏几何形态改变、心肌收缩和舒展功能的重要因素，基质金属蛋白酶2及抑制剂是胶原代谢的主要调节物质。心肌梗死后心力衰竭大鼠接受骨髓干细胞移植后，心肌组织中这些指标会发生哪些变化？目的：观察接受骨髓干细胞移植治疗的心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠，心肌组织中胶原含量与比例、基质金属蛋白酶2及抑制剂的变化。设计：随机对照实验。单位：解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系。材料：实验于2004—07／2005—12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成。实验动物由北京医科大学动物实验中心提供，选取4周龄清洁级雄性SD大鼠用于骨髓间充质干细胞的制备，200～250g清洁级雌性SD大鼠14只用于心肌梗死后心力衰竭模型的制备，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。方法：采用梯度离心法与贴壁培养法分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞。结扎雌性SD大鼠左冠状动脉制作急性心肌梗死后心力衰竭模型。造模成功4周后将14只大鼠随机分为2组：移植组大鼠梗死后心肌瘢痕区接受雄性SD大鼠来源的5×10^6骨髓间充质干细胞。对照组大鼠梗死后心肌瘢痕区接受等体积磷酸盐缓冲液。每组7只。主要观察指标：移植治疗后21d：①以苏木精-伊红染色和Masson染色评价左心室形态。②以免疫组织化学分析心肌基质金属蛋白酶2及抑制剂与瘢痕区Ⅰ型及Ⅲ型胶原的变化。③以Western杂交检测基质金属蛋白酶2及抑制剂蛋白的变化。结果：14只大鼠均进入结果分析，无脱失值。与对照组大鼠比较，骨髓间充质干细胞移植大鼠心肌梗死瘢痕区Ⅰ型胶原增加，Ⅲ型皎原降低，心肌组织基质金属蛋白酶抑制剂表达增加，基质金属蛋白酶2表达降低，心室壁增厚，心室腔缩小，心功能增强。结论：骨髓间充质干细胞移植心力衰竭大鼠后，基质金属蛋白酶2及抑制剂发生了动态变化，进而影响瘢痕区胶原比例重建，逆转心力衰竭心脏异常的胶原平衡。

摘要：背景:目前仍缺乏有效手段修复心力衰竭后受损心肌,逆转心肌病理性重塑。作为一种新的治疗策略,用正常肌细胞和治疗性基因干预受损心肌正逐渐显示出其在改善心功能方面的优势。目的:观察腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的有效性和稳定性。并以携带肌浆网钙离子ATP酶(sarcoplasmicreticulumCa(2+)ATPase,SERCA2a)基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞,治疗心力衰竭大鼠,比较SERCA2a基因治疗,骨髓间充质干细胞移植以及骨髓干细胞基础的SERCA2a基因治疗慢性心力衰竭大鼠的效果。设计:随机对照实验。单位:解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系。材料:选取购于北京医科大学动物实验中心的4周龄雄性SD大鼠作为骨髓供体。选取体质量200~250g雌性成年SD大鼠作为细胞移植和基因治疗受体。以雄性大鼠Y染色体sry基因鉴定供体移植细胞是否在雌性大鼠受体心肌内存活。实验所用Ad-SERCa2a,Ad-EGFP的构建由我科鲁小春博士完成;第3和8代骨髓间充质干细胞自行分离培养。方法:实验于2004-07/2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成。对30只雌性SD大鼠进行左冠状动脉结扎,制作急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型。将造模成功的29只大鼠随机分为4组:基因治疗组7只,干细胞移植治疗组7只,基因修饰的干细胞移植组8只,腺病毒空载体对照组7只,分别予以单纯SERCA2a基因、MSC移植、SERCA2a基因修饰的骨髓间充质干细胞移植及腺病毒空载体干预。分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用携带SERCA2a及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-SERCA2a-GFP)转染第3和8代骨髓间充质干细胞。主要观察指标:采用流式细胞仪检测不同代骨髓间充质干细胞的Ad-SERCA2a-GFP转染率。分别在治疗前及治疗后14,21d采用超声心动图检测大鼠心功能。采用免疫组化法检测大鼠心脏Ⅷ因子表达;采用RT-PCR和Western杂交检测SERCA2a的基因和蛋白水平表达,并按照说明书检测宿主SERCA2a功能活性。结果:①转染率:腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的转染率超过80%,第3代骨髓间充质干细胞与第8代的转染率比较,差异无显著性意义(P>0.05)。②大鼠心功能:治疗后14d,与腺病毒空载体对照组相比,其余3组左室射血分数均明显升高(P<0.01)。治疗后21d,与腺病毒空载体对照组相比,干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组大鼠室壁增厚;干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组左室射血分数和左室短轴缩短率改善率持续升高(P<0.01),基因治疗组两指标改善率较治疗14d时下降。与腺病毒空载体对照组相比,基因修饰的干细胞移植组左室前壁和室间隔收缩期纵向峰值速度显著升高(P<0.01),左室前壁和室间隔舒张期纵向峰值速度亦呈现相同改善(P<0.01)。③心肌SERCA2a的基因、蛋白水平表达和功能活性,以及Ⅷ因子表达:携带SERCA2a基因的骨髓干细胞在宿主心肌能有效地合成和表达有功能的SERCA2a蛋白。与腺病毒空载体对照组相比,基因修饰的干细胞移植组SERCA2a基因、蛋白表达和酶活性均显著增强。干细胞移植组心力衰竭大鼠心脏瘢痕区可观察到Ⅷ因子表达。结论:①第3和8代骨髓间充质干细胞均具有高腺病毒转染率,骨髓间充质干细胞是基因治疗的良好细胞载体,其介导的SERCA2a基因治疗对衰竭心肌具有持续稳定的心功能改善作用。②骨髓间充质干细胞移植改善心功能的作用可能与促进血管新生有关。

摘要：目的与方法：根据人淀粉样前体蛋白（ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＰＰ）基因ｃＤＮＡ序列设计的引物，提取总ＲＮＡ，利用ＲＴＰＣＲ方法检测非神经、类神经及神经细胞系ＡＰＰ基因的表达。结果：利用专门设计的引物不能检测野生型ＣＯＳ７细胞中ＡＰＰ基因的表达，但可以检测转染人ＡＰＰ基因的非神经元类ＣＯＳ７细胞，类神经元的野生型ＰＣ１２及人神经母细胞瘤细胞ＳＨＳＹ５Ｙ细胞中ＡＰＰ基因的表达。