摘要：为探究利用CRISPR/Cas13a系统获得抗马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)马铃薯的可行性,通过设计靶向PVX中TGBp1基因的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建CRISPR/Cas13a基因编辑载体,以马铃薯栽培种Désirée为受体材料进行稳定遗传转化,并通过机械摩擦接种法鉴定转基因植株对PVX的抗性。结果显示,成功构建了靶向PVX的PVX-Cas13a载体,并获得了表达Cas13a的转基因马铃薯植株,对其中3个高表达Cas13a的株系进行PVX抗性鉴定,发现在接种PVX 10~20 d后,转基因植株系统叶上无明显发病症状,且PVX积累量均显著低于未接种PVX对照。表明靶向PVX的CRISPR/Cas13a系统能够有效抑制该病毒的积累,这为马铃薯抗PVX育种提供了一条有效策略。

摘要：病毒病是限制我国马铃薯生产的重要因子之一。本研究通过引物设计和体系优化建立了一套多重RT-PCR检测方法,可以在一个反应体系中同时检测6种马铃薯病毒和1种马铃薯类病毒以及1个马铃薯内参基因,包括马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)、马铃薯M病毒(potato virus M,PVM)、马铃薯S病毒(potato virus S,PVS)、马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)、马铃薯A病毒(potato virus A,PVA)、马铃薯卷叶病毒(potato leaf curl virus,PLRV)、马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunitⅠ,CoxⅠ)基因的特异片段,产物大小依次为181、226、275、565、630、681、359、500 bp,符合理论预期。采用建立的方法以相应病毒和类病毒的质粒作模板进行检测,其检测灵敏度在1.6×10^(-3)~1.8×10^(-1) ng/μL。用该方法检测田间未知样品,结果与DAS-ELISA检测结果高度相符,同时PVY、PVM、PVS、PVX 4种病毒的检出率高于DAS-ELISA,表明该方法准确可靠,可用于以上马铃薯主要病毒和类病毒的快速检测。

摘要：根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计特异引物,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术进行PSTVd检测研究。为避免由于提取的RNA降解或者RT-PCR反应质量不高所造成的假阴性问题,在检测过程中引入马铃薯线粒体NADH脱氢酶ND2亚基基因mRNA为内对照,该内对照的一个引物跨越了该基因内含子区域,只对剪接后的mRNA进行特异扩增而不扩增其本身DNA。利用内对照引物和PSTVd特异引物进行双重RT-PCR检测,分别扩增出190 bp的内对照基因特异片段和360 bp的PSTVd特异条带,与预期引物设计大小一致。引入的内对照可以较好地监控PSTVd的RT-PCR检测过程。