摘要：制备重组蛋白pET28a-LHRH-PTD-GFP,利用绿色荧光蛋白GFP,研究LHRH的介导和PTD蛋白的转膜作用。以重组质粒pET28a-PTD-GFP为模板,设计含有LHRH基因序列的PCR引物,经过PCR扩增后双酶切,克隆到原核表达载体p ET28(a)中,构建重组表达质粒pET28a-LHRH-PTD-GFP,并在大肠杆菌中诱导表达,纯化目的蛋白。通过GFP的荧光特性,检测LHRH介导的PTD蛋白的转膜作用。成功构建LHRH-PTD-GFP原核表达载体,融合蛋白相对分子质量约为30 k,纯化得到蛋白浓度为1.62 mg/m L的LHRH-PTD-GFP重组蛋白。荧光显微镜检测结果显示,He La细胞内显现明显的绿色荧光,证明LHRH介导的PTD蛋白具有很好的跨膜特性。该研究结果为下一步构建以LHRH为靶向,以PTD为转膜作用的肿瘤治疗药物提供了理论基础和技术支撑。

摘要：目的:为防治A型产气荚膜梭菌α毒素引起的肠毒血症及气性坏疽等相关疾病,构建并高效表达中和α毒素(CPA)的特异性双价单链抗体,并对其生物学活性进行初步研究。方法:以全人源噬菌体抗体库中筛选得到的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体sc Fv基因为模板,PCR的方法扩增两条单链抗体片段并通过引物设计引入中间连接肽G4S或(G4S)3,亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化*** BL21,IPTG诱导表达、鉴定及表达产物的层析纯化;Western blot和间接ELISA方法检测与抗原的免疫结合活性;通过体外检测抗体抑制CPA水解卵磷脂的活性和溶血活性以及体内小鼠攻毒保护试验初步研究双价单链抗体的生物学活性。结果:双酶切鉴定及基因测序结果表明构建的双价单链抗体sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均正确,诱导表达后经12%SDS-PAGE分析,两者均以包涵体形式表达且蛋白分子量符合理论值大小,Western blot和间接ELISA分析结果显示,构建的双价单链抗体与抗原CPA具有特异结合活性,且sc(Fv)2-15与抗原的结合活性明显高于sc(Fv)2-5和sc Fv,体外与体内生物活性试验结果进一步证明,sc(Fv)2-15中和毒素的能力较sc(Fv)2-5和sc Fv具有明显优势。结论:成功制备了抗A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源双价单链抗体,为进一步研究该毒素引发的各类疾病的诊断和治疗奠定了基础。

摘要：为了研究促黄体激素释放激素(LHRH)介导的TAT蛋白核心肽PTD的跨膜作用,测定目的蛋白的转导效率,试验以pET28a—PTD—GFP质粒为模板,设计含LHRH基因序列的特异性PER引物,经PCR扩增后双酶切,并克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒并在*** BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,超声破碎后进行硫酸铵梯度沉淀,取上清液用Phenyl—HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱纯化,将纯化后的目的蛋白加到体外培养的HeLa细胞中,观察转导情况,分析目的蛋白浓度对转导效率的影响。结果表明:PER扩增得到目的基因LHRH—PTD-GFP,并成功构建出重组质粒pET28a—LHRH—PTD-GFP,在*** BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达出目的蛋白,经Phenyl—HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱成功纯化出目的蛋白,在荧光显微镜下HeLa细胞内显现明显的绿色荧光,经分析转导效率与目的蛋白浓度之间呈正相关,回归系数为0.096 6,决定系数(R^2)为0.937 8。说明LHRH介导的TAT蛋白核心肽PTD具有很好的跨膜特性,转导效率对目的蛋白浓度具有依赖性,在一定浓度范围内随着目的蛋白浓度的增加转导效率增大。