摘要：目的通过构建人天然F ab段噬菌体抗体库为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法。方法取4个健康献血员新鲜血液各200m l,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA。轻链PCR产物和质粒载体pCom b3经SacⅠ和X baⅠ酶切,由T 4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL 1-B lue,扩增后提取质粒,构建轻链库。轻链库和重链Fd段PCR产物经X hoⅠ和SpeⅠ酶切,同样方法连接转化XL 1-B lue,加入辅助噬菌体VCSM 13产生噬菌体抗体全库。酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段。结果提取的淋巴细胞总RNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增。F ab全库库容达5.4×106,酶切证实有插入片段。结论本研究构建的人天然F ab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体及从肿瘤组织中提取肿瘤抗原用于免疫治疗奠定基础。

摘要：一般认为,尿石形成的前题是结晶尿,但在正常人尿中往往也可见到草酸钙结晶。因此尿中结晶生长和凝集对结石形成更为重要。为研究焦磷酸盐、柠檬酸盐对草酸钙结晶生长和凝集的作用,本文设计了草酸钙结晶生长模型,以分析焦磷酸盐,柠檬酸盐在体外对草酸钙结晶生长,凝集的作用,并对草酸钙结晶生长模型作了研究。

摘要：目的构建含人粘附分子-2(ICAM-2)启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并将其用于异种器官移植转基因。方法利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM-2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离、切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM-2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化菌质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细胞,流式细胞仪检测CD59蛋白表达。结果得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoRⅠ消化此重组质粒,产生5.5及0.5kb两片段;以HindⅢ消化重组质粒,得到5.45及0.55kb两片段,以KpnⅠ/HindⅢ双酶切质粒时,出现5.0、0.55、0.4kb3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列。流式细胞仪检测重组基因表达阳性。结论含人ICAM-2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础。

摘要：目的　克隆大鼠白细胞介素 - 10 (IL - 10 )cDNA的全长序列 ,为其分子生物学利用奠定基础。方法　无菌条件下切取大鼠的脾脏 ,收集脾细胞 ,用脂多糖 (LPS)刺激培养 4h ;离心得到一定量细胞 ,加入变性液 ,一步法提取细胞总RNA ;逆转录合成IL - 10的第 1条链 ,用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增 ,得到期望相对分子质量的PCR产物 ;酶切后插入pcDNA3 载体 ,转染感受态细胞进行筛选制备 ,并行PCR、酶切鉴定和测序。结果　脾细胞经LPS刺激后IL - 10转录水平增加 ,从提取的RNA转录产物中容易扩增出期望相对分子质量的PCR产物 ,酶切和PCR鉴定证明所得IL - 10cDNA相对分子质量与基因库报告的相近 ,测序结果表明得到的IL -10cDNA序列与基因库报告的序列完全一致。结论　大鼠的IL -

摘要：目的构建肿瘤增殖基因Ki-67小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肾癌细胞Ki-67基因表达的阻抑作用,探索肾癌基因治疗新的途径。方法设计有小发夹机构的2条Ki-67siRNA对应模板DNA序列,煺火处理后克隆至pSliencer3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-Ki-67。将pSliencer-Ki-67转染人肾癌786-0细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot检测Ki-67表达。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-Ki-67构建成功。其可显著抑制786-0细胞Ki-67mRNA、Ki-67蛋白表达。结论成功构建的Ki-67siRNA表达质粒pSliencer-Ki-67能抑制人肾癌786-0细胞Ki-67基因表达。

摘要：目的制备转人琢1,2岩藻糖基转移酶(HT)基因小鼠显微注射DNA片段。方法引物两端设计酶切识别位点,聚合酶链反应(PCR)扩增HTcDNA全长序列,两端含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切识序列;回收HTcDNA片段并与PMD18-T载体连接,EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切纯化质粒鉴定;EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pMD18-HTcDNA重组质粒和pCMV-MCS质粒,回收HTcDNA片段和pCMV-MCS质粒片段,进而连接,转化感受态细菌,纯化质粒对其进行酶切、PCR和测序鉴定;PvuⅠ和NotⅠ依次单酶切重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,回收大小约2.85kb片段,溶于适量显微注射用缓冲液。结果成功构建了重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,酶切回收了2.85kb的显微注射DNA片段。结论通过基因工程技术可以获得转人HT基因小鼠显微注射DNA片段,包含基因表达元件,可以用于显微注射法建立转人HT基因小鼠。

摘要：目的:构建含杂合增强子UI的人衰变加速因子(DAF)重组基因的表达载体,应用于转基因动物克服异种器官移植排斥反应的研究。方法:ClaI/EcoRI双酶切质粒pXMT2得到UI增强子插入片段(0.3Kb),将其插入pBlue-scriptIISK+克隆载体的相应酶切位点之间;XbaI/BamHI双酶切质粒pGEM-7zf-DAF,得到含人ICAM-2启动子及DAFcDNA序列的插入片段(3.7Kb),将其也插入到pBluescriptIISK+克隆载体的相应酶切位点之间。随后转化细菌,阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。设计引物行PCR特异扩增检验。结果:特异性3组酶切重组载体均产生了符合要求的相应条带;PCR扩增出特异的330bp及321bp的片断,符合设计要求。结论:含杂合增强子UI的人衰变加速因子(DAF)重组基因的表达载体构建成功。

摘要：在对可控性全替代式人工膀胱的选材、制作工艺、结构、性能、植入手术方法等进行了系统研究后,我们研制成实验用隔膜型人工膀胱.在体外与动物实验的基础上,我们进行人用人工膀胱总体设计及其贮尿囊结构及造型研究,并对研制样品进行流体力学性能测试和人体盆腔内原位置入实验,以评估人工膀胱行使人体膀胱功能的可能性和原位植入的可行性及合理性[1].

摘要：目的 :构建含人粘附分子 -2(ICAM -2)启动子的人衰变因子 (DAF)重组基因的真核细胞表达载体 ,运用于转基因动物克服异种器官排斥的研究。方法:双酶切本室已构建质粒pGEM -7Zf-DAF ,得到含人ICAM -2启动子及DAFcDNA序列的插入片段 (3.7Kb) ;双酶切pcDNA3真核表达载体 ,得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段DNA作为载体序列 (4.4Kb) ;两段DNA进行连接反应后转化细菌 ;阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。根据人的ICAM -2启动子、DAFcDNA序列 ,设计引物行PCR特异扩增检验。结果:特异性3组酶切重组表达载体 ,产生符合设计的相应条带 ;PCR扩增出特异的318bp及1.7Kb的DNA片段 ,符合设计要求。结论 :含人ICAM

摘要：目的通过基因工程技术构建人α1,2岩藻糖苷转移酶(ht)基因表达载体,以期HT在猪细胞表达,削减异种抗原α-Gal的合成。方法HindⅢ/XbaⅠ双酶切pcDNA3和pRc/CMV-htcDNA2种质粒,回收所需酶切片段,进而连接、转化感受态细菌,纯化pcDNA3-htcDNA重组质粒,对其进行多酶切、PCR和测序鉴定。结果多酶切反应产物电泳可见内切酶PvuⅠ酶切产生6.5kb片段,BglⅡ酶切产生4.6kb和1.9kb片段,ApaⅠ酶切产生5.6kb和0.9kb片段,HindⅢ/XbaⅠ酶切产生5.4kb和1.1kb片段,结果与设计相符。PCR反应扩增出1098bp的htcDNA核心片段。序列测定结果与Genbank中htcDNA序列比对,表明在pcDNA3质粒多克隆位点成功定向连接了htcDNA全长序列。结论成功构建了pcDNA3-htcDNA重组质粒。