摘要：目的利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）检测强直性脊柱炎（AS）患者外周血单个核细胞白细胞介素2受体α（IL-2Rα）mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析.方法根据GenBank提供的序列设计一对引物和一条TaqMan探针.提取外周血单个核细胞（PBMC）总RNA,加入FQ-RT-PCR反应体系,产物切胶回收与pUCm-T载体连接,用T7RNA聚合酶转成cRNA,制备系列浓度参照物.对其特异性、线性、精密度和探针稳定性进行评价.定量HLA-B27阳性组与阴性组AS患者PBMC的IL-2Rα mRNA基因表达并探讨与血浆可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R）的相互关系.结果成功构建了IL-2Rα mRNA的cRNA参照物.线性范围7～107 cells/ml,批内CV 8.4%,批间CV 9.6%.对各30例HLA-B27阳性与阴性AS的IL-2Rα mRNA检测表明,与正常对照组结果比较,阳性组与阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R有明显差异（P〈0.01）.IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%.结论 FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL-2Rα mRNA比sIL-2R更能反映强直性脊柱炎患者的炎症活动程度.

摘要：根据GenBank中弓形虫B1基因序列,设计1对引物和1条TaqMan探针。从感染弓形虫小鼠尿液提取弓形虫总DNA,先用普通PCR扩增获得目的基因产物,将纯化的回收产物与pMD18-T载体连接,测序证实为目的片段后,制备系列浓度参照品。再优化实时荧光定量PCR反应体系,并对体系的灵敏度、重复性、线性、特异性和参照品稳定性进行评价。其灵敏度为104拷贝/ml;批内变异系数为2.42%,批间变异系数为4.18%,线性为103～107拷贝/ml,特异性为100%,参照品稳定。该法检测鼠尿样弓形虫DNA具有方便、灵敏、特异和重复性好等优点。

摘要：目的:建立可用于检测无创标本尿液中弓形虫DNA的TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time-FQ-PCR)并初步评价其临床应用价值。方法:根据登录GenBank的弓形虫B1基因序列,设计1对引物和1条TaqMan探针。提取感染弓形虫小鼠尿液总弓形虫DNA,先用普通PCR扩增目的基因片段,将回收产物与PMD-18T载体连接。经测序证实为目的片段后,制备系列浓度参照物,优化FQ-Real-Time-PCR反应体系,并对灵敏度、重复性、特异性、线性、探针稳定性进行评价。检测3份外周血全血中弓形虫DNA阳性者的尿样,再作初步临床应用评价。结果:成功构建尿液中弓形虫DNA参照物,灵敏度为弓形虫DNA 104拷贝/ml。批内变异系数(CV)为2.42%,批间CV为4.18%。线性为103～107拷贝/ml,特异性100%。检测3份外周血弓形虫DNA阳性就诊者的尿样,阳性率为100%(3/3)。结论:用Real-Time-FQ-PCR能检测小鼠尿液弓形虫DNA和人尿液弓形虫DNA,该方法具有方便、灵敏、特异、结果重复性好等优点。

摘要：目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。