摘要：【目的】构建多靶向siRNA表达载体对里氏木霉碳阻遏抑制因子CRE1、CRE2、CRE3和CRE4进行同时多靶向siRNA干扰,以研究其对里氏木霉纤维素酶基因表达的调控作用。【方法】根据此前研究筛选出沉默cre1、cre2、cre3和cre4基因的4个最佳siRNA序列,设计并构建了A多靶向表达载体,另根据cre1、cre2、cre3和cre4基因中所含有的5个共有序列设计并构建了B多靶向表达载体,将两者转化至里氏木霉QM9414。经筛选后分别在48 h和120 h对各转化子进行纤维素酶酶活力测试(CMC活力测试和滤纸酶酶活力测试)及利用qPCR检测相关基因的表达。【结果】通过RT-qPCR测定结果表明,两种表达载体均可同时抑制里氏木霉的分解代谢物阻遏基因cre1、cre2、cre3和cre4的表达,纤维素酶活力比出发菌株明显升高,多靶向抑制菌株的CMC酶活和滤纸酶活比出发菌株平均提高了1.95倍和2.66倍。纤维素酶基因cbh1和egl1的表达水平比出发菌株也有明显提升,平均提高了3.83倍和3.95倍。纤维素酶相关基因xyr1的表达水平与出发菌株相比也明显上升,平均提高了2.78倍。【结论】多靶向沉默里氏木霉的碳代谢阻遏蛋白有利于解除葡萄糖效应,提高非还原糖的利用,从而提高纤维素酶的产量,使纤维素酶的表达得到更大的提升,为里氏木霉表达纤维素酶在分解代谢物阻遏基因调控方面提供了实验依据和新的技术思路。

摘要：【背景】里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种比其他真菌小很多的多细胞真核微生物,在工业上受到广泛应用,而里氏木霉QM9414是目前研究最多基因产纤维素酶丰富的突变菌株。【目的】构建里氏木霉中组蛋白赖氨酸甲基化酶(Histone Lysine Methyltransferase)基因hkmt的siRNA沉默载体和过表达载体来降低或者增强hkmt在里氏木霉QM9414中的表达量,以分析其对里氏木霉纤维素代谢的调控作用。【方法】根据里氏木霉hkmt序列设计siRNA沉默片段并用反转录的方法获得过表达hkmt片段。将沉默片段和过表达片段克隆至里氏木霉组成型表达载体中,构建沉默hkmt的载体和过表达hkmt的载体,并将其转化里氏木霉QM9414。通过荧光显微镜观察重组菌的菌丝生长情况,此外对各重组菌进行纤维素酶的滤纸酶活性(Filter Paper Enzyme Activity,FPA)和羧甲基纤维素钠酶活性(Carboxymethyl Cellulose Enzyme Activity,CMCA)的测试;利用荧光定量PCR的方法检测hkmt、纤维素酶基因cbh1、egl1及木聚糖酶激活因子xyr1的表达量变化。【结果】通过使用荧光显微镜观察,发现沉默、过表达hkmt重组菌的菌丝形态均与出发菌株无明显差异。荧光定量PCR测定结果表明,沉默载体和过表达载体可以分别沉默和促进hkmt的表达。沉默hkmt重组菌株中FPA和CMC酶活力相比出发菌平均升高2.5倍。此外,纤维素酶相关基因和激活因子在沉默hkmt重组菌中的表达量均有所增加,但是在过表达hkmt重组菌株中以上相应指标均呈现相反的趋势。【结论】组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因表达产物负调控里氏木霉产纤维素酶基因的表达,这为提高里氏木霉产纤维素酶水平提供了参考,并为里氏木霉产纤维素酶的表观遗传调控研究提供了新的证据。

摘要：使用组成型siRNA干扰载体对里氏木霉碳阻遏抑制因子CRE1进行siRNA干扰以研究其对里氏木霉纤维素酶基因表达的调控作用。根据里氏木霉cre1基因序列设计siRNA干扰片段。利用里氏木霉组成型表达载体将干扰片段分别构建至里氏木霉cre1干扰载体并将其转化里氏木霉QM9414。分别在48和144 h对各转化子进行纤维素酶酶活力测试(CMC酶活力测试和滤纸酶活力测试)及利用qPCR检测相关基因的表达。在诱导144 h时转化子的两种酶活力平均约比出发菌株高出1倍。qPCR检测cre1基因的表达结果表明,转化子的cre1表达量比出发菌株平均降低约50%,而ace1基因表达量变化不大。其他纤维素酶相关基因的表达水平也均高于出发菌株。通过组成型表达siRNA干扰里氏木霉cre1基因可以明显调控纤维素酶基因的表达,为研究纤维素酶的基因表达与调控提供参考。