摘要：目的 建立HPV基因分型质控品.方法 收集宫颈脱落细胞标本300份,通过表面等离子谐振法和测序法检测标本型别,根据GenBank中参考序列设计各型别L1基因扩增引物,通过PCR扩增、连接转化构建包含不同型别L1基因重组质粒,通过30个重组质粒PCR鉴定和序列测定,并将测定序列用BLAST软件进行比对.结果 收集的标本包含了HPV 6、16、18等30种不同型别HPV感染.PCR扩增片段大小和设计引物扩增片段长度相符,除了HPV CP8304外,其余型别均在1 500～2 000 bp之间.重组质粒PCR鉴定与目的 片段相符,测序结果 与GenBank中的参考序列一致性在99%以上,在碱基数为1 500 bp的比对序列中不一致碱基数为11个.结论 建立了30种不同型别HPV L1基因分型质控品,覆盖了所有最常见型别,涵盖了14种高危型、3种中危型和13种低危型.

摘要：目的:构建了29种人类EGFR基因突变体质控品,为人类EGFR基因突变检测试剂盒的性能评价提供了可靠的质控物质。方法:根据人类EGFR全基因序列,应用Primer Premier 5.0软件在选取的序列区域设计引物,通过PCR介导的定点突变技术引入突变位点、PCR产物与克隆载体连接,转化感受态细菌,筛选阳性克隆等,建立了包含不同人类EGFR基因突变体的质控品。结果:对29种人类EGFR基因突变体质控品进行序列测定,并将测序结果进行BLAST比对,结果表明成功建立了人类EGFR基因突变体质控品。结论:本研究建立的EGFR基因突变体质控品涵盖了EGFR基因的29种突变位点,覆盖了目前最常见的EGFR基因突变类型,能够用于评价国内大多数EGFR基因突变检测试剂盒。

摘要：目的:对多重PCR-毛细管电泳法检测Y染色体微缺失进行评价。方法:选择Y染色体无精子因子(AZF)区域的15个序列标签位点(STS),设计特异性的引物,分成4个不同的多重PCR体系。首先提取临床外周全血样本的基因组DNA。将样本的DNA分别加入到4个不同的PCR体系中进行扩增。将获得的目的 DNA片段进行毛细管电泳,并根据预设的AZF marker计算出各检测位点的碱基长度,然后分析临床样本的Y染色体微缺失情况。结果:该方法能够准确检测出临床样本的Y染色体AZF a区域缺失、AZF b区域缺失和AZF c区域缺失等缺失;检测限约为3 ng·反应^(-1);正常男性临床样本的检测结果是均未发生Y染色体微缺失;在210例无精子症和少精子症患者中,该方法能够准确检测出19例AZF区域微缺失,包括AZF a区域缺失1例,AZF b区域缺失2例,AZF c区域缺失13例,AZF bc区域缺失1例和AZF abc区域缺失2例。结论:多重PCR-毛细管电泳法具有很好的临床适用性,在临床上可以用于Y染色体微缺失检测,为临床遗传咨询提供建议。

摘要：目的:建立检测鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因V600E突变的荧光聚合酶链式反应(PCR)方法,为黑色素瘤的药物靶向治疗提供新的基因检测方法。方法:根据BRAF基因序列V600E位点区域设计特异性的引物和探针,建立该检测方法。检测BRAF基因V600E突变的黑色素瘤临床样本、BRAF基因V600E突变质粒和正常临床样本,评价方法的准确性、灵敏度和特异性。结果:BRAF基因V600E突变的黑色素瘤临床样本在V600E检测体系中具有特异性的扩增;检测灵敏度约为101拷贝/反应;正常临床样本在V600E检测体系中没有特异性的扩增,均是V600E突变阴性。结论:建立的方法可以用于检测黑色素瘤临床样本中的BRAF基因V600E突变。

摘要：目的:建立检测CYP2C19基因多态性的PCR-荧光探针法,为预测CYP2C19代谢药物的疗效提供新的检测试剂盒。方法:应用Primer Express 3.0软件针对人类CYP2C19基因CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性位点设计引物和探针。以经测序确认为杂合突变型、纯合突变型或野生型的人类全血基因组DNA(genomic DNA,g DNA)样本为模板,应用荧光PCR法筛选合适的引物和探针,建立和优化CYP2C19基因多态性检测荧光PCR法。然后用特定浓度且基因型已知的人类全血g DNA样本作为质控品评价该方法的准确性、灵敏度和特异性。最后用100例临床样本验证该方法的临床适用性,并与直接测序结果进行比较,计算Kappa值。结果:建立的CYP2C19基因多态性检测PCR-荧光探针法,能准确地检测出CYP2C19*2、*3和*17多态性位点杂合突变型和纯合突变型;灵敏度为每个反应体系约1 ng;以基因型已知为野生型的全血g DNA为模板进行检测的结果显示均为野生型。临床样本的检测结果显示与测序结果的一致性较好,Kappa值为1.00。结论:建立的CYP2C19基因多态性检测方法具有很好的准确性、灵敏度和特异性,且具有很好的临床适用性,可以用于CYP2C19代谢的药物疗效的预测。

摘要：目的:建立检测ROS1融合基因的荧光PCR法,为肺癌病人的个体化药物治疗提供新的检测试剂盒。方法:根据人类ROS1基因的外显子和融合伙伴基因的外显子序列设计引物和探针,建立ROS1融合基因的荧光PCR法。然后采用不同ROS1基因融合的假病毒质粒作为质控品,评价方法的准确性、检测限和特异性。检测350例临床样本,并与直接测序结果进行比较,评价方法的临床适用性。结果:建立的ROS1融合基因PCR-荧光探针法,能准确检测出14种不同的ROS1融合基因;检测限是不高于总量0.01μg的RNA模板;正常人RNA的结果显示为融合突变阴性。临床样本的结果与测序结果的一致性好,Kappa值为1.00。结论:建立的ROS1融合基因检测方法具有很好的准确性、检测限和特异性,并且具有很好的临床适用性。

摘要：目的:建立高危型人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7质控品,用于评价高危型HPV E6/E7 mRNA检测试剂盒的性能。方法:根据高危型HPV 16和HPV 18的E6/E7基因序列设计引物,从感染HPV 16和HPV 18宫颈上皮细胞中提取DNA作为模板,通过PCR扩增获得带有目的基因的产物。采用限制性内切酶对带有目的基因的PCR产物和表达载体分别进行酶切,将目的基因与表达载体连接,然后转化DH5α感受态细胞,筛选出阳性菌落进行测序。然后将阳性菌液进行超声诱导,制备假病毒溶液。采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对假病毒溶液提取的RNA进行鉴定。结果:通过序列测定和荧光定量RT-PCR法检测,结果表明成功建立了高危型HPV E6/E7假病毒质控品。结论:本研究建立了HPV E6/E7质控品的方法,可为高危型HPV E6/E7 mRNA检测试剂的质量控制提供质控品。

摘要：目的:建立一种可以检测高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的荧光PCR方法,为临床宫颈癌的筛查提供新的检测试剂盒。方法:选择高危型HPV的L1区基因序列作为靶序列,应用Primer Premier 5.0软件在选取的序列区域设计引物和探针,建立和优化该检测方法。通过评价其准确性、灵敏度和特异性,建立一种荧光PCR方法,用于高危型HPV基因分型的检测。结果:用HPV L1基因型质控品进行检测时,该试剂盒针对高危型HPV L1基因质控品均具有较好的阳性结果;检测灵敏度约为10～100拷贝.反应体系-1;低危型HPV L1基因质控品则为阴性结果,用正常人白细胞全基因组DNA进行检测时,没有HPV特异性扩增信号出现。结论:建立的高危型HPV基因分型荧光PCR检测方法具有良好的准确性、检测灵敏度和特异性,可以用于临床宫颈癌的筛查。

摘要：目的:建立人类K-ras基因突变质控品,用于K-ras基因突变检测试剂盒的注册检测工作。方法:根据人类K-ras基因序列设计引物,通过定点突变技术引入突变位点,将获得的PCR产物与克隆载体连接,转化感受态细菌后筛选阳性克隆,获得了包含不同突变位点的重组质粒,建立了人类K-ras基因突变质控品。结果:对人类K-ras基因突变质控品进行序列测定,并将测序结果进行BLAST比对,结果表明成功建立了人类K-ras基因突变质控品。结论:建立的K-ras基因突变体质控品包括常见的Kras基因12密码子突变类型,可以用于指导Kras基因突变检测试剂盒的注册检验工作。

摘要：目的:建立BCR-ABL融合基因质控品,评价人类BCR-ABL融合基因突变检测试剂盒的性能。方法:根据人类BCR-ABL e1a2和e14a2型融合基因m RNA序列,设计覆盖断裂点序列,合成目的融合基因序列。用限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ对含有目的融合基因的质粒和表达载体进行酶切,连接酶切产物。将连接产物转化DH5α感受态细胞,筛选单个阳性菌落进行验证。将正确的单个菌落进行超声诱导,制备假病毒溶液。用荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对假病毒溶液提取的RNA进行检测。结果:PCR结果和测序结果表明成功构建人类BCR-ABL融合基因e1a2和e14a2型假病毒质粒;荧光RT-PCR结果表明构建的e1a2和e14a2型假病毒质粒能够表达目的 RNA,并且能被市售试剂盒正确检出,可以作为RNA质控品。结论:本研究建立人类BCR-ABL融合基因RNA质控品,用于评价BCR-ABL融合基因突变检测试剂盒的性能,为BCR-ABL融合基因相关白血病的临床诊断及靶向治疗提供指导。