摘要：目的制备GII.3[P12]型人源诺如病毒(human norovirus,HuNoV)广州株GZ2013-L20的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)和多克隆抗体,系统表征其免疫原性特征和受体结合能力,为HuNoV防控提供数据支撑。方法以GZ2013-L20毒株基因组为模板,扩增ORF2并构建重组转座载体,转化至大肠埃希菌DH10Bac获得重组杆状病毒质粒Bacmid-L20-ORF2,在昆虫细胞sf9中表达目的VLP,采用透射电镜、SDS-PAGE、Western blot(WB)和受体结合实验等方法对纯化后VLP进行鉴定。此外,将VLP免疫小鼠获得多克隆抗体,通过间接ELISA和受体结合阻断试验进行评价。结果构建了重组杆状病毒Bacmid-L20-ORF2,并成功获得目的毒株VLP;透射电镜显示颗粒直径约为30 nm;SDS-PAGE和WB结果显示蛋白相对分子质量(Mr.×10^(3))约58;受体结合实验表明,目的VLP与分泌型唾液受体(A型、B型、AB型和O型)、O型非分泌型唾液受体以及猪胃黏蛋白均能有效结合;VLP多克隆抗体效价达到2×10^(5),且与20种(20/28)基因型HuNoV的衣壳蛋白具有交叉免疫反应;受体结合阻断实验显示,多克隆抗体仅对同型VLP具有中和阻断效果,而对GII.2、GII.4、GII.8和GII.17等基因型VLP没有中和作用。结论GII.3[P12]型HuNoV广州株VLP与分泌型和非分泌型唾液受体均呈现较强的结合能力,其多克隆抗体具有免疫结合广谱性,但中和阻断效果仅对同型病毒有效,其结果为疫苗研发的理性设计提供基础数据。

摘要：目的对犬恶丝虫酪蛋白激酶2β亚基(Csnk2b)部分基因片段进行克隆、原核表达及免疫反应性分析。方法根据犬恶丝虫cDNA文库中筛选出的Csnk2b部分基因片段设计引物,以含有插入Csnk2b部分基因片段的噬菌体DNA为模板,进行PCR扩增。产物亚克隆至原核表达载体,构建重组载体pGEX-4T-1-Csnk2b,双酶切鉴定。将其转入大肠埃希菌(***)Rosetta(DE3)中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达的重组蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)以小鼠抗犬恶丝虫阳性血清为一抗,分析重组蛋白免疫反应性。结果Csnk2b部分基因片段PCR扩增产物约为700 bp,测序结果与cDNA文库中筛选得到的序列一致。重组表达载体pGEX-4T-1-Csnk2b双酶切鉴定正确。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导后重组蛋白GST-Csnk2b表达,相对分子质量(M r)约为45 000,与预期大小一致。Western blotting分析表明,重组蛋白能被小鼠抗犬恶丝虫阳性血清识别。结论克隆并表达了犬恶丝虫Csnk2b重组蛋白,且该蛋白具有免疫反应性。

摘要：目的建立犬贾第虫巢式PCR检测方法并进行验证。方法根据犬贾第虫Rnase P基因序列设计两对特异性引物,通过优化Mg2+浓度和退火温度建立巢式PCR检测方法,并进行灵敏度和特异性验证。用优化的巢式PCR方法检测60份犬临床粪样。结果建立的巢式PCR方法的最佳Mg2+浓度为3.0 mmol/L;最佳退火温度为53℃;对犬贾第虫的最低检测量可达1个虫体DNA/ml;对柔嫩艾美尔球虫、伊氏锥虫、弓形虫、阴道毛滴虫、犬心丝虫等寄生虫基因组DNA的扩增结果均为阴性;60份犬临床粪样贾第虫的检出率为61.7%。结论建立的巢式PCR检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于犬贾第虫感染的临床检测。