摘要：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ras GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白2(G3BP2)基因敲除的293T细胞系,并初步探讨了G3BP2基因缺失对于塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)增殖的影响。采用激光共聚焦试验观察病毒感染是否引起应激颗粒的产生;设计、构建靶向G3BP2基因的px459-sgRNA表达载体并转染进293T细胞;通过嘌呤霉素压力筛选以及亚克隆得到细胞株,经过Western blot、基因测序的方式鉴定细胞株;CCK-8法测定细胞增殖速度;Western blot、RT-qPCR、噬斑试验分别检测SVA感染后病毒蛋白VP1的表达水平、VP1的拷贝数和细胞上清液的病毒滴度;设计并构建SVA核糖体进入位点(IRES)的双荧光素酶报告系统,双荧光素酶报告试验测定病毒启动子的启动活性。结果:病毒感染引起应激颗粒的产生;筛选得到1株G3BP2基因缺失10 bp的293T细胞系(HEK 293T G3BP2^(-/-)),其细胞活力与未敲除细胞相比无显著差异;Western blot、RT-qPCR、噬斑试验均显示G3BP2敲除后显著抑制了病毒的增殖;双荧光素酶报告试验表明G3BP2敲除后下调了病毒的翻译启动活性。综上,本研究获得了1株HEK 293T G3BP2^(-/-)细胞系,该细胞通过下调病毒的启动活性抑制病毒的增殖,为进一步探讨G3BP2对SVA复制的影响奠定基础。

摘要：旨在构建伪狂犬病病毒(PRV)UL21基因缺失重组病毒。采用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白系统9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术,设计针对UL21的单导向RNA(sgRNA),并构建UL21基因左右两侧同源臂质粒(pUC19 UL21-Left-Right-GFP),将其与PRV基因组共转染HEK-293T细胞,通过蚀斑纯化获得PRV-ΔUL21病毒,并通过PCR和Western blot检测方法鉴定该毒株成功缺失了UL21基因。结果表明,CRISPR/Cas9技术可用于构建PRV基因缺失重组病毒,为PRV致病机制研究提供重要依据。

摘要：本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定G3BP1敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量RT-PCR方法检测SVA感染后基因组拷贝数,Western-blot检测病毒蛋白VP1表达水平;间接免疫荧光(IFA)检测敲除G3BP1基因对细胞内应激颗粒形成的影响。结果显示,筛选出1株G3BP1基因缺失5 bp的293T细胞(G3BP1-/-293T),其增殖速度与正常细胞相比未见显著差异;荧光定量RT-PCR结果和Western-blot结果表明,在病毒感染早期,敲除G3BP1基因显著抑制SVA基因组复制和病毒蛋白表达;IFA结果显示,敲除G3BP1基因不会影响其细胞内应激颗粒的形成,表明G3BP1对SVA复制的影响与应激颗粒的形成无关。综上,本研究获得1株G3BP1-/-293T细胞系,该细胞能够在病毒感染早期抑制SVA复制,为进一步研究G3BP1对SVA复制的影响奠定了基础。

摘要：牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD)是近年来我国新出现的一种牛传染性疾病。本研究根据LSD病毒(LSDV)的LSD022基因保守区域,设计出引物和探针,经过反应条件优化,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,测试了其敏感性、特异性和重复性。结果发现,本方法敏感性达到15 copies/μL,不与其他牛病病毒和山羊痘弱毒疫苗AV41发生反应,变异系数均小于3%。用本方法和OIE推荐的普通PCR方法检测发病牛场94份临床样品,LSDV检出率分别为62%和37%,其中阳性样品2种方法检测符合率为96.7%,说明本方法敏感性、特异性和重复性较好,可用于LSDV检测。