摘要：为优化枸杞子多糖油乳佐剂(LBPOA)的最佳配方,使用三因素二水平Box-Behnken试验设计,以枸杞子多糖为药物模型,磁悬搅拌法制备LBPOA。采用响应曲面法对影响乳液成乳能力的主要因素进行考察,枸杞子多糖油乳佐剂承载枸杞子多糖的质量作为响应值,用二项式数学模型对配方进行优化。以口蹄疫病毒样颗粒(foot-and-mouth disease virus-like particles,FMD-VLPs)为抗原模型,考察LBPOA的生物相容性和对疫苗生物活性的影响。结果,枸杞子多糖油乳佐剂的最佳成乳条件为:33.905%的EL-35,LBP的浓度为9.996 mg/m L,37.55%的无水乙醇,最佳载水量为9.33%。LBPOA在10000 r/min离心10 min,粒径、电位、PDI均无显著变化。于4℃、25℃和37℃条件下将其放置7 d,粒径、PDI无较大波动。优化后的枸杞子多糖油乳佐剂与FMD-VLPs乳化免疫小鼠,对小鼠主要脏器无明显损伤。37℃条件下,LBPOA包封FMDVLPs,抗原活性没有大幅度下降。上述结果表明,Box-Behnken试验设计能够有效优化LBPOA配方,可作为其他疫苗佐剂及复合物配方的分析模型及有效手段;LBPOA具备良好的稳定性、生物相容性,能够维持蛋白质抗原的生物活性。

摘要：利用CRISPR/Cas9技术建立敲除RNA结合蛋白(RALY)基因的PK-15细胞系PK-15-RALY^(-/-),并初步探究RALY对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响。根据GenBank中猪的RALY基因的外显子,设计合成sgRNA并克隆至PX459载体;将质粒转染PK-15细胞,并采用有限稀释法筛选单克隆细胞株,经Western-blot及测序检测RALY基因的敲除效果。通过RT-qPCR检测FMDV感染PK-15-RALY^(-/-)和PK-15细胞后FMDV m RNA的转录水平,Western-blot检测FMDV-VP0、FMDV-VP3和FMDV-VP1的表达水平,最后检测子代病毒感染力。测序结果证实RALY基因发生了移码突变,且Western-blot无法检测到PK-15-RALY^(-/-)细胞中RALY蛋白的表达。FMDV感染两种细胞后,RT-PCR结果显示,FMDV在PK-15细胞中的m RNA水平显著低于PK-15-RALY^(-/-)细胞,Western-blot结果显示,VP0、VP3和VP1蛋白在PK-15-RALY^(-/-)细胞中的表达显著高于PK-15细胞,病毒感染力测定结果显示,PK-15-RALY^(-/-)细胞中子代病毒滴度显著高于PK-15细胞。上述结果表明,本研究成功构建了RALY基因敲除的PK-15细胞系,首次表明RALY可以抑制FMDV复制,为进一步开展RALY在细胞内调控病毒复制机制研究奠定了基础。

摘要：为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。

摘要：提取鸭瘟病毒(DPV)疫苗株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank已发表的DPV UL区UL24、UL23、UL22基因序列,选择保守序列设计了两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R),L包括部分UL24、部分TK,R包括部分TK及部分UL22,L和R的拼接片段中TK基因内部缺失468个核苷酸.将L片段和R片段克隆于pBluescript M13-载体上,获得了pSKLR;再将含2个LoxP位点的表达绿色荧光蛋白的基因表达盒插入pSKLR的L片段和R片段之间构成转移载体pSKLR-EGEP-LoxP.大量提取pSKLR-EGEP-LoxP质粒,用脂质体转染鸭胚成纤维细胞,24 h后蛋白被正确表达,表明含LoxP位点的表达EGFP的鸭瘟病毒TK基因缺失的重组转移载体被成功构建.