摘要：本研究用宇佐美曲霉Aspergillus usamii的5家族β-甘露聚糖酶AuMan5A为母本,借助同源建模、分子对接及分子动力学模拟等理性设计方法,将AuMan5A的N-末端和C-末端分别截去3个无规则的氨基酸残基,构建出截短的β-甘露聚糖酶AuMan5AN3C3.将AuMan5A和AuMan5AN3C3的编码基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达,对表达产物进行了初步纯化并分析比较了其酶学特性及各自的表达水平.结果表明,reAuMan5A和reAuMan5AN3C3的最适温度Topt均为70℃,reAuMan5AN3C3在60℃的半衰期t1/260为38 min,较reAuMan5A(t1/260=40 min)略有降低;在相同表达条件下,reAuMan5AN3C3上清液的β-甘露聚糖酶活性为73.4 U/mL,较reAuMan5A的52.8 U/mL提高了39.0%;纯化的reAuMan5AN3C3酶比活性为182.7 U/mg protein,较reAuMan5A的126.3 U/mg protein提高了44.7%.与reAuMan5A相比,reAuMan5AN3C3对角豆胶的Km值下降不明显,Vmax值有显著提高.

摘要：以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)为研究对象,对其底物亲和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数Km值较低的突变酶AuMan5AY111F.首先采用同源建模和分子对接模拟等方法预测AuMan5A与甘露二糖对接复合物的空间结构;在此结构上使用PyMol软件统计到距甘露二糖8以内的38个氨基酸位点.其次对不同来源的、与AuMan5A一级结构序列全同率大于50%的β-甘露聚糖酶进行多序列比对;排除21个保守氨基酸位点,依据17个非保守位点上的氨基酸性质及其所处空间位置,选择AuMan5A中的Tyr111、Phe206和Tyr243作为拟突变氨基酸,将它们分别替换为性质相似的或在其他β-甘露聚糖酶序列中出现频率高的氨基酸,形成一系列拟突变酶.最后采用MM-PBSA法计算AuMan5A及其拟突变酶与甘露二糖的结合自由能(ΔGbind),其中AuMan5AY111F的ΔGbind为-237.7kJ/mol,较其他酶的ΔGbind均低.基于该理性设计采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Tyr111的密码子TAC突变为编码Phe111的TTC,构建出突变酶基因(Auman5AY111F).分别将Auman5AY111F和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,并对重组表达产物reAuMan5AY111F和reAuMan5A进行分离纯化和动力学常数测定.结果表明:reAuMan5AY111F对瓜尔豆胶的Km值由突变前的3.9mg/mL降低为2.5mg/mL;而突变前后酶的Vmax值变化不大.该研究运用多种生物信息学软件对提高AuMan5A底物亲和力进行了理性设计,并通过定点突变证实之,这为β-甘露聚糖酶乃至其他各种酶底物亲和力的定向改造提供了新的技术策略.