摘要：目的 利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术建立可同时检测miR-888和miR-891a的体系,并评估其在精液鉴定中的应用价值。方法 通过设计不同荧光修饰的报告基团的水解探针实现对miR-888和miR-891a的双重ddPCR检测,对5种体液(外周血、月经血、精液、唾液、阴道分泌液)共75份样本进行检测,采用Mann-Whitney U检验进行差异性分析,通过ROC曲线分析评估miR-888和miR-891a区分精液的能力并获得鉴别的最佳截断值。结果 该体系双重检测与单独检测结果差异无统计学意义,检测灵敏度可达到0.1 ng总RNA,批内与批间变异系数均小于15%。经双重ddPCR检测,精液中miR-888和miR-891a的表达量均高于其他体液。经ROC曲线分析,miR-888的AUC为0.976,最佳截断值为2.250 copies/μL,判别正确率为97.33%;miR-891a的AUC为1.000,最佳截断值为1.100copies/μL,判别正确率为100%。结论 本研究成功建立了双重ddPCR检测miR-888和miR-891a的方法,体系的稳定性和重复性良好,可用于精液鉴定,miR-888和miR-891a均具有较高的精液鉴别能力,且miR-891a的判别正确率更高。

摘要：目的 建立一种高效、准确的鉴别月经血与外周血的方法体系并探究该体系的应用能力。方法 设计miR-451a、miR-21-5p的引物、探针,建立并优化基于TaqMan技术的qPCR检测体系;对58份样本(20份月经血、20份外周血、6份唾液、6份精液、6份阴道分泌液)中miR-451a与miR-21-5p的表达情况进行检测,探索候选miRNA分子在5种体液中的表达规律;最终建立区分目标体液的鉴别方法并用模拟案件样本对其准确性进行验证。结果 本研究所建立体系及方法可实现血液与非血液、月经血与外周血100%准确区分。结论 本研究基于TaqMan qPCR技术成功建立了运用miR-451a/miR-21-5p表达量比值鉴别月经血与外周血的方法体系,该体系鉴别能力良好,有望应用于实际法医案件中。

摘要：本文建立双重数字PCR检测miR-891a-5p和内参基因RNU6b鉴定精液的方法,并评估其对实际案件的检验能力。通过设计5’端不同荧光修饰的TaqMan MGB探针,建立检测miR-891a-5p和RNU6b的双重数字PCR方法,对5种体液(包括精液、外周血、月经血、唾液、阴道分泌液)共107份样本进行检测,以非参数检验和ROC曲线分析评价所建方法鉴别精液的能力;进行灵敏度试验并制备不同比例的混合斑、模拟降解精斑等测试体系的准确性。结果表明,精液miR-891a-5p表达水平显著高于其他体液(P<0.0001),其与内参基因RNU6b的表达情况证实方法能够实现100%的精液鉴定。所有测试条件下的样本(包括0.008μL的微量精液、按1︰100与其他4种体液混合的精斑以及室外放置14 d、紫外照射24 h或洗涤过的精斑等)均被正确鉴别。本研究成功建立了一种基于数字PCR技术准确、灵敏地鉴定精液的方法,显示出良好的鉴别能力和应用前景,可在法医实际检案中广泛应用。