摘要：目的构建人结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TI MP1)基因腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)表达质粒,并观察其在HEK293细胞中的表达,检测目的蛋白的生物学活性。方法采用PCR技术,分别设计引物扩增所需序列并进行PCR鉴定。再采用分子克隆的方法,以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)序列连接CTGF和TI MP1并克隆到AAV表达质粒pSNAV2.0构建重组质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TI MP1。把重组质粒转染HEK293细胞,用双重免疫荧光和Western blot的方法对重组质粒的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性,ELISA法检测细胞培养上清液中TI MP1蛋白的含量。结果PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的CTGF和TI MP1基因序列的AAV表达质粒。双重免疫荧光和Western blot检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性,ELISA法结果证实重组载体能够高表达TI MP1蛋白。结论成功构建了双表达质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TI MP1,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的目的蛋白,为基因治疗椎间盘退变的研究工作奠定了基础。

摘要：背景:细胞凋亡在椎间盘退变过程中发挥重要作用,而导致细胞凋亡的因素很多,氧化应激是导致细胞凋亡的一个重要因素。目的:从细胞内信号转导水平验证过氧化氢对大鼠髓核细胞氧化应激损伤的影响。设计、时间及地点:单一样本观察,试验于2008-03/10在山东省创伤骨科研究所完成。材料:p38MAPK特异性阻断剂(SB203580)、JNK特异性阻断剂(SP600125)购自碧云天生物技术有限公司;大鼠椎间盘来自2只新生24h SD大鼠。方法:原代培养大鼠髓核细胞,将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液,随即分为4组:H202组:用0,50,100,200,400,800μmol/L H2O2刺激;对照组:不加刺激的细胞;SB203580+H2O2组:给予特异性p38MAPK阻断剂SB203580预孵育细胞,再给予H2O2刺激;SP600125+H2O2组:给予特异性JNK阻断剂SP600125预孵育细胞,再给予H2O2刺激。上述处理后检测相关指标。主要观察指标:以免疫组织化学检测P-p38和P-JNK的表达情况及表达位置;Western印迹法检测SAPK/JNK、p38MAPK及其磷酸化组分的表达。结果:H2O2能够激活髓核细胞内p38和JNK的活性;SB203580能够有效地抑制p38MAPK的活性,而SP600125则能够有效的抑制JNK的活性;免疫荧光显示P-p38MAPK和P-JNK在细胞质和细胞核均有表达中,而对照组未发现。结论:大鼠髓核细胞受氧化应激后可通过p38MAPK和JNK通路导致细胞凋亡。