摘要：目的构建乙型肝炎病毒(HBV)复制表达载体,验证其在HepG2细胞系中的复制和表达。方法通过引物设计合成,以实验室构建的HBV C1亚型质粒通过PCR、酶切、克隆等分子生物学技术,构建HBV复制表达载体。利用转染试剂(Fugene HD Transfection Reagent)将载体质粒导入HepG2细胞,分别检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA在不同时间点的表达。结果酶切和测序结果均证实载体构建成功,通过瞬时转染细胞证实培养上清液中可检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA。结论利用分子克隆技术成功构建了HBV复制表达载体,可以在HepG2细胞系中复制表达。通过进一步改造,可以为HBV表型耐药以及复制活性研究提供支持。

摘要：目的建立检测人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的多重巢式PCR（nPCR）和多重逆转录PCR（RT-PCR）方法。方法针对HIV-1的gag、pol和gp41区设计3套引物，分别建立检测HIV DNA的多重nPCR和检测HIV RNA的多重RT—PCR方法；以建立的PCR方法对150例HIV抗体阳性患者及50例阴性患者进行检测，以ELISA／免疫印迹实验（Westen blot，WB）相结合的抗体检测结果（ELISA／WB）为金标准，计算所建立的PCR方法的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确性、可重复性；分别用建立的多重nPCR和多重RT-PCR检测73份阳性标本，并与HIV-1核酸序列扩增技术（NASBA法）进行检测敏感度的比较；对43份检测阳性的DNA标本进行亚型鉴定。结果多重nPCR的检测敏感度为98．0％（147／150），多重RT—PCR的敏感度为91．3％（137／150），2种方法的特异度均为100％（50／50），多重nPCR和多重RT—PCR的阳性预测值分别为98．0％（147／150）和91．3％（137／150），阴性预测值均为100％（50／50），准确性分别为98．5％和93．5％。可重复性分别为96．7％（87／90）和93．3％（84／90）；多重nPCR的检测敏感度（97．3％）高于NASBA法（72．6％），差异有统计学意义（X^2=17．34，P〈0．01），多重RT—PCR的检测敏感度（79．5％）与NASBA法相比，差异无统计学意Y-（X。=0．94，P=0．332）；检测的43份HIV DNA阳性标本分别为37份B’亚型、5份AE亚型和1份BC亚型。结论成功地建立了多重nPCR和多重RT—PCR方法，操作简便、价格低廉，具有较高的敏感度和特异度和可重复性，能覆盖我国最主要的流行病毒株。

摘要：目的建立检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的多重巢式PCR(nPCR)和多重反转录PCR(RT-PCR)方法。将其与已经上市的NASBA法试剂盒进行检测敏感性比较;探讨血浆RNA水平对PCR检测敏感性的影响;评价该方法用于我国HIV-1感染者诊断的价值。方法针对HIV-1的gag、pol和gp41区设计3套引物,建立检测HIV DNA的多重nPCR和检测HIVRNA的多重RT-PCR方法;分别以建立的PCR方法和NASBA法对119例HIV阳性患者进行检测,比较2者的检测敏感性;将患者分为不同的病毒载量组,比较PCR方法在各组患者中的检测敏感性差异;使用建立的PCR方法对10例可疑急性感染者进行检测;扩增HIV-1膜区C2-C3段,对nPCR检测阳性的43例DNA样本进行亚型鉴定。结果多重nPCR的检测敏感度为97.5%(116/119),多重RT-PCR的敏感度为78.2%(93/119),2者的特异度均为100%(50/50),多重nPCR和多重RT-PCR的阳性预测值分别为97.5%(116/119)和78.2%(93/119),阴性预测值均为100%(50/50),准确性分别为98.2%和84.6%。经比较,多重nPCR和多重RT-PCR的检测敏感度都高于NASBA法。在病毒载量<103copy/mL的患者,nPCR的检测敏感性高于RT-PCR,在病毒载量在(103～104)copy/mL的患者及病毒载量≥104copy/mL的患者,2者的敏感性比较相近,均接近100%;检测的10例可疑急性感染者中,有5例患者的nPCR和RT-PCR检测结果阳性,抗体在随访过程中阳转,证实为HIV急性感染者;检测的43例DNA样本分属于B’亚型(37例),AE亚型(5例)和BC亚型(1例)。结论本课题组建立的PCR检测方法可以对我国主要流行的B’、AE和BC亚型病毒株得到很好的扩增效果;nPCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较小,RT-PCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较大;PCR方法可以用于HIV急性感染者的早期诊断。

摘要：目的 建立结合多重反转录巢式PCR技术检测HIV RNA的小型集合NAT,用于MSM人群急性感染的筛查诊断.方法 利用2008年10月至2009年3月期间从3名HIV窗口期感染者、30名HIV慢性感染者、97名健康人采集冻存的EDTA抗凝血浆建立小型集合NAT.将10份待测标本混合组成1个集合,离心富集病毒,提取RNA 针对HXB2的nt5783-nt6228和nt1235-nt2012区分别设计2对引物 采用多重RT-PCR、巢式PCR扩增2个目标区的核酸片段,对结果阳性的集合中标本进一步分别检测.确定小型集合NAT的灵敏度,并进行验证.应用建立的方法对1 005份与上述标本同一时期收集的MSM人群的HIV抗体阴性血浆进行检测.结果 （1）成功扩增出目标区的2条特异性片段,灵敏度为162拷贝/ml （2）对3份HIV窗口期感染者标本用小型集合NAT方法盲法验证的结果和预期一致 （3）用多重RT-PCR和巢式PCR对30份HIV抗体阳性标本检测,阳性率100%（30/30） （4）发现1 005份血浆标本中有1份为HIV RNA阳性,追踪随访发现HIV-1抗体转阳.结论 本研究中建立多引物小型集合RT-PCR、巢式PCR结合的小型集合NAT的敏感性好,可用于MSM人群HIVG感染窗口期筛查检测.