摘要：目的建立肉眼直接判读检测结果的铜绿假单胞菌OprD2耐药基因环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法。方法对2011年12月至2012年6月西南医院微生物室收集的47株铜绿假单胞菌标本进行前瞻性研究。利用LAMP针对铜绿假单胞菌OprD2耐药基因设计两对引物，特异性识别OprD2的6个独立区域来快速扩增。通过在LAMP反应体系中加入核酸染料羟基萘酚蓝（HNB），建立可直接用肉眼判读检测结果的LAMP反应体系，并用该方法检测和分析47株铜绿假单胞菌OprD2耐药基因的分布情况及其与抗生素耐受性的相关性。结果设计出针对铜绿假单胞菌OprD2耐药基因可直接肉眼判读结果的恒温扩增检测方法，其检测体系的灵敏度为17．414μg／L，比常规PCR方法（灵敏度：174．14μg／L）高10倍。49％（23／47）的菌株OprD2基因缺失，OprD2基因缺失株的头孢噻肟、左氧氟沙星、氨曲南、哌拉西林、亚胺培南和美罗培南耐药率分别为100％（23／23）、57％（13／23）、48％（11／23）、48％（11／23）、48％（11／23）和43％（10／23）。与OprD2基因阳性株相比，OprD2基因缺失株的亚胺培南、左氧氟沙星和美罗培南耐药比例明显升高，差异有统计学意义（χ2值分别为9．155、4．846、4．037，P值分别为0．002、0．028、0．045）。结论建立了可直接肉眼判读检测结果的铜绿假单胞菌OprD2耐药基因LAMP快速技术。OprD2基因缺失导致铜绿假单胞菌以亚胺培南为主的耐药，因此明确OprD2基因分布状况有助于临床抗菌药物的选用。

摘要：目的研究乙型肝炎病毒(HBV)核心区的突变模式。方法在核酸序列比对的基因上,设计靶向HBV各基因型核心区的通用引物,PCR扩增血清病毒DNA,经DNA测序和随后的序列分析,检测和分析核心区的突变模式。结果在34例可检测样本中,共有23例患者存在HBV核心区突变;其中,基本核心启动子区(BCP)的A1762T(50.0%)和G1764A(52.9%)是最常见的突变位点,并且,通常表现为双碱基突变;其次是核心(C)基因区的L60V氨基酸突变(17.6%);就各基因区的突变频率而言,BCP区、前核心(Pre-C)区和C基因区突变患者分别有18、6、10例,其中,BCP区通常表现为A1762T和G1764A双突变(94.7%),pre-C区以G1896A最为常见(83.3%),C基因区则主要是L60V的氨基酸单突变(50.0%)。结论HBV核心区最常见的突变形式是BCP区A1762T和G1764A的碱基双突变;由于HBV核心区基因具有复杂的突变模式,因此,研究HBV核心区基因突变模式对HBV感染的病情预测和预后判断具有重要的临床应用价值。

摘要：目的设计针对结核杆菌耐链霉素(SM)rpsL43密码子的发夹型DNA探针,尝试运用荧光分光光度仪直接观测液相中发夹探针与rpsL43密码子扩增产物杂交后荧光信号,从而检出该位点突变。方法运用软件Beacon designer设计针对rpsL43密码子的发夹探针,应用荧光分光光度仪检测rpsL43密码子扩增片段与探针杂交后荧光信号,并比较扩增产物测序结果。结果通过荧光分光光度仪观测到结核杆菌标准株及SM耐药rpsL43密码子扩增产物杂交荧光信号存在显著差异;20株SM耐药组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,SM耐药组rpsL43密码子突变检出率为70%,测序法突变检出率为65%,发夹探针杂交法假阳性株1例(504S)。结论应用荧光分光光度仪直接观测发夹探针液相杂交荧光信号具有简单、灵敏等优特点;rpsL43密码子点突变是重庆地区SM耐药的主要因素之一。

摘要：目的应用基于非对称发夹探针的杂交链反应技术,检测肺炎克雷伯菌不对称PCR产物,建立一种新的病原菌快速检测方法。方法采用Array Designer 4.0软件,针对肺炎克雷伯菌的16SrDNA可变区域设计非对称发夹式DNA探针,优化探针浓度,以不对称PCR扩增肺炎克雷伯菌16rDNA可变区所制备的单链DNA为靶序列,采用HCR进行检测和分析。结果 HCR体系中发夹探针最佳浓度为1μmol/L;当靶序列初始浓度≥0.05μmol/L时,通过琼脂糖凝胶电泳可观察到明显的HCR聚合物;不对称PCR法制备的单链DNA可以启动杂交反应。结论应用基于非对称发夹探针的杂交链反应技术检测病原菌具有反应体系简单,无需酶促反应等优点,可对血流感染病原菌基因组进行简便、快速、特异的检测。

摘要：目的设计结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB330codon位点分子信标,运用荧光显微镜观测分子DNA探针与embB330codon扩增产物杂交后的荧光信号,比较该位点突变株与标准株。方法运用软件Beacondesigner设计embB基因包含330codon的分子信标,应用荧光显微镜检测embB330codon扩增片段与探针杂交后荧光信号,比较扩增产物测序结果。结果通过荧光显微镜观测到结核标准株及embB330codon突变株PCR产物与探针杂交后荧光信号差异有统计学意义;33株耐乙胺丁醇组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐乙胺丁醇组embB330codon突变检出率为3%,测序法突变检出率为3%。结论分子信标技术可以有效检测embB330codon单碱基靶点突变;应用荧光显微镜观测荧光杂交信号非常灵敏。

摘要：目的针对耐乙胺丁醇(EMB)的结核分枝杆菌embB303密码子位点,设计扩增引物及特异性发夹DNA探针其相应的单侧延长臂发夹DNA探针,建立发夹DNA探针芯片技术,并运用荧光显微镜观测发夹DNA探针与扩增产物的杂交荧光信号。方法运用Beacon designer软件,设计embB基因包含303密码子的发夹DNA探针,荧光显微镜检测embB303密码子扩增片段与发夹DNA探针杂交后荧光信号,扩增产物测序结果作比较。结果通过荧光显微镜观测到结核标准株及embB303密码子突变株PCR产物与探针杂交后荧光信号存在显著差异;33株耐EMB组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐EMB组embB303密码子突变检出率为7%,测序法突变检出率为6%。结论应用荧光显微镜可以高灵敏观测发夹DNA探针与靶序列的杂交荧光信号,从而有效检测单碱基突变;embB303密码子点突变不是结核分枝杆菌耐EMB的主要原因。

摘要：目的探讨并明确量子点核酸传感器检测微生物核酸样本时探针长度对杂交效率和检测结果的影响。方法首先合成金黄色葡萄球菌16S rDNA探针,然后在其5′端添加不同长度的重复碱基序列,分别合成5条长度不同的以胸腺嘧啶结尾的探针;采用巯基法固定金黄色葡萄球菌16S rDNA探针于石英晶体微阵列上,并用石英晶体微天平(QCM)检测样品频率漂移量以判断不同核酸长度时的杂交效率,并用荧光显微镜观察形成不同双链复合物的荧光强度和荧光效率,以此判断不同碱基序列长度探针对荧光效率和杂交效率的影响,并运用SPSS软件对数据进行统计分析。结果对于普通的短链核酸杂交反应,随着探针长度增加,杂交效率呈现依次递增的趋势,当离子强度为40mmol/L时,杂交效率和荧光强度增加最快,其后再增加探针长度,杂交效率增加速度变缓。结论探针长度是影响杂交效率的主要原因之一,通过增加探针长度可以提高杂交效率和荧光强度,但同时也会增加二聚体产生概率,故应根据实际需要设计长度适合的探针。

摘要：目的针对结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因463密码子设计发夹DNA探针,尝试运用荧光分光光度计直接观测液相中发夹DNA探针与katG基因463密码子扩增产物杂交后的荧光信号,从而检出该位点突变。方法运用软件Beacon designer设计katG基因包含463密码子的发夹DNA探针,应用荧光分光光度计检测扩增片段与探针杂交后荧光信号,同时对扩增产物测序并作比较。结果通过荧光分光光度计观测到结核标准株及耐异烟肼katG基因463密码子PCR产物与发夹DNA探针杂交后荧光信号差异有统计学意义;16株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组katG基因463密码子突变检出率为34%,测序法突变检出率为37%。结论应用荧光分光光度计直接观测发夹DNA探针液相杂交荧光具简单、灵敏等优特点;katG基因463密码子突变是结核分枝杆菌耐异烟肼的主要原因之一。

摘要：目的　研制与开发组合靶基因自动检测仪应用软件。方法　应用VB6 .0编程语言及Access 97数据库实现压电石英谐振频率的实时检测与分析。结果　实现了组合靶基因自动检测仪压电石英谐振频率的实时检测、数据分析、结果保存与数据转换等。结论　组合靶基因自动检测仪应用软件是一类可实时检测与分析压电石英谐振频率的新型实用性软件 ,可广泛应用于压电石英谐振频率的检测。

摘要：目的建立一种快速检测血液感染病原菌的方法。方法选取7种常见血液感染病原菌,在其16SrRNA末端和23S rRNA始端的保守区设计通用引物,对16S-23S rRNA基因间区进行扩增,然后将PCR产物的电泳图谱进行机器码识别,以鉴定病原菌。结果通用引物能扩增出7种病原菌,且每种菌具有不同片段长度(bp):大肠埃希菌(716、808),金黄色葡萄球菌(732、827),铜绿假单胞菌(833),表皮葡萄球菌(630、722、817),肺炎链球菌(606),肺炎克雷伯菌(550、705、797),粪肠球菌(591、693);此图谱可经机器码识别,对各种病原菌进行快速鉴定。结论采用通用引物PCR和机器码识别技术可简便、快速、特异地鉴定常见血液感染病原菌。