摘要：目的构建Wnt信号通路抑制因子Dickkopf1(DKK1)、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)基因沉默重组腺病毒载体,观察其对MG63细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性和钙离子浓度影响作用。方法设计出特异性针对DKK1、Sost和无关对照序列(Scr),构建DKK1、Sost沉默重组腺病毒载体,用q PCR法和蛋白印记(Western blot)法选出沉默效率最好的扩增DKK1、Sost沉默重组腺病毒载体,并用荧光显微镜观察计算病毒滴度。MG63细胞被分成空白对照组、沉默DKK1(Ad-sh DKK1)组、沉默Sost(Ad-sh Sost)组、沉默DKK1+Sost(Ad-sh DKK1+Ad-sh Sost)组4组,分别用优选出的沉默效率最好的sh DKK1和sh Sost腺病毒载体转染MG63细胞,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)检测观察细胞增殖、考马斯亮蓝蛋白定量法测定ALP活性、流式分析法测定钙离子浓度。结果 1DKK1 p Ad-sh DKK1-1和Sost p Ad-GFP-shRNA-2沉默效率最高;2与空白对照组对比,沉默DKK1组、沉默Sost组、沉默DKK1+Sost组的细胞光吸收值(OD)、ALP活性测定值均升高,而钙离子浓度均降低,以沉默DKK1+Sost组变化最明显,组间比较具有统计学差异(P<0.01和P<0.05)。结论 DKK1、Sost沉默可促进MG63细胞增殖、提高ALP活性,降低钙离子浓度,尤以二者同时沉默时的作用最强。

摘要：背景:研究证实,胰岛素生长因子和肿瘤坏死因子α分别具有调节成骨细胞和破骨细胞功能。目的:实验拟验证补肾复方中药对骨质疏松模型大鼠骨密度及胰岛素样生长因子Ⅰ、肿瘤坏死因子α的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2007-03在广州中医药大学动物中心和广州中医药大学附属骨伤科共同完成。材料:选择SPF级6月龄健康雌性SD大鼠68只,体质量约260～280g。随机分为空白组和手术组,分别为22只和46只。术后3个月后从两组随机各选出10只以确定造模成功。造模后大鼠随机分为3组,模型组、雌激素组、中药组各12只。剩余12只为空白对照组。补肾中药主要由淫羊藿、补骨脂、丹参、黄芪等10味中药组成,含生药量为1430g/L,由广州中医药大学附属骨伤科医院制剂室提供。方法:中药组给予补肾中药按4.8g/kg灌胃,1次/d;雌激素组给予尼尔雌醇按1mg/kg灌胃,1次/周;模型组和空白组给予蒸馏水按10mL/kg灌胃,1次/d,连续治疗3个月。主要观察指标:分别测量各组大鼠全身骨密度、腰椎骨密度、双髋部骨密度,以及外周血清中的胰岛素样生长因子Ⅰ、肿瘤坏死因子α及雌激素含量。结果:最后进入结果分析64只。①造模组全身骨密度低于空白组(P0.05)。③与模型组比较,中药组能显著降低肿瘤坏死因子α水平和提高雌激素水平(P均<0.05),与雌激素组比较差异无显著性意义;中药组还能提高胰岛素样生长因子Ⅰ的含量(P<0.05),雌激素组胰岛素样生长因子Ⅰ水平明显均低于其余3组。结论:中药补肾复方在治疗骨质疏松的过程中类雌激素样作用可能是其主要作用机制,但其对胰岛素样生长因子Ⅰ的影响不同于雌激素。

摘要：目的构建沉默人Bcl-2拮抗1基因(Bak1)的重组腺病毒,感染人成骨肉瘤细胞MG63并检测其对细胞活性的影响。方法设计特异性针对Bak1的sh RNA序列及无关对照序列scr,分别构建重组腺病毒表达载体,感染人成骨肉瘤细胞MG63,利用q PCR和Western blot检测Bak1基因沉默后的MG63细胞Bak1 m RNA及蛋白的表达,筛选出能高效沉默目标基因的重组腺病毒表达载体,并对其进行包装扩繁,荧光显微镜观察计算病毒滴度,利用MTT法检测高效沉默的重组腺病毒感染MG63细胞后的细胞活性。结果 (1)测序列结果表明,sh RNA序列已成功克隆入到p Ad-GFP载体上;(2)sh RNA-3的沉默效率最高,扩增纯化后腺病毒滴度达到7.7×108GFU/ml;(3)MTT检测显示与NC对照组相比,sh RNA-3组MG63细胞活性增强(P<0.5)。结论成功构建了沉默Bak1的重组腺病毒,为进一步研究Bak1的功能奠定了基础。

摘要：目的构建人B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)过表达载体p ENTER-Bcl2,检测其在人成骨肉瘤细胞中的表达及对细胞活性的影响。方法利用q PCR扩增Bcl2全长c DNA,构建表达载体p ENTER-Bcl2,经测序证实后将其转染至人成骨肉瘤细胞(MG63)中,利用q PCR和Western blot方法检测Bcl2的表达,利用MTT检测细胞活性。结果DNA测序结果显示构建的p ENTER-Bcl2载体表达与实验设计相符;Ad-Bcl2组Bcl2 mRNA表达较NC对照组和空白对照组高(P均<0.01);Ad-Bcl2组Bcl2蛋白表达较NC对照组和空白对照组高(P<0.05,P<0.01);与NC对照组比较,Ad-Bcl2感染细胞活性增强(P<0.05)。结论构建的p ENTER-Bcl2能在MG63细胞中过表达Bcl2;AdBcl2可以提高细胞的活性,这为研究Bcl-2在骨质疏松发生时的分子生物学机制奠定了基础。

摘要：Wnt/β-catenin信号通路是重要的细胞信号转导途径,在细胞的增殖、分化中发挥重要作用。目前的研究表明Wnt/β-catenin信号通路在骨代谢中发挥重要作用,该通路的异常与骨质疏松的发生有关。Wnt/β-catenin拮抗剂可以抑制Wnt/β-catenin信号通路,导致通路表达异常,进一步研究Wnt/β-catenin信号通路拮抗剂,设计出阻断该通路拮抗剂的物质,可为骨质疏松的治疗提供一种新的途径。