摘要：背景与目的:肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败的最主要原因,也是癌症术后复发及转移的主要原因。本研究旨在探讨MDR1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组慢病毒对人肺腺癌A549细胞和对顺铂耐药的A549/DDP细胞的MDR1基因的抑制作用。方法:设计获得针对MDR1的短发卡状RNA(small hair pin RNA,shRNA)的寡核苷酸序列,退火后插入线性化的pSUPER载体(H1启动子下游)。把构建获得的载体转染A549细胞,RT-PCR法检测其对MDR1的干扰作用,筛选确定MDR1基因RNAi有效靶序列;合成靶序列的OligoDNA,与含启动子和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的PTM载体连接产生PTM-siMDR1慢病毒载体;用重组慢病毒体外感染A549和A549/DDP细胞。结果:成功构建可以表达针对MDR1的发卡状RNAi,能有效的下调MDR1的表达。成功构建获得针对MDR1基因的慢病毒载体PTM-siMDR1,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为0.5×109TU/mL。感染PTM-siMDR1的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性明显提高,逆转倍数达3.81倍。结论:siMDR1重组慢病毒载体感染A549/DDP细胞,能明显改善其对顺铂的耐药性。

摘要：背景:干细胞移植早期出现的大量细胞缺失可明显影响移植效果,目前已证实AKT1基因的过表达能明显抑制细胞凋亡。目的:探讨过表达AKT1基因的猪自体骨髓间充质干细胞移植能否在体内缺氧状态下抑制干细胞凋亡,及其修复受损心肌的效果。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-08/2007-02在苏州大学完成。材料:健康雄性梅山猪24只,由苏州大学动物实验中心提供。方法:扩增AKT1 cDNA基因,并构建表达载体。扩增后,使用慢病毒转染系统进行基因重组,以其为载体转染建立稳定过表达AKT1基因的猪自体骨髓间充质干细胞,并行BrdU标记。24只猪均应用明胶海绵栓塞冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,造模后4周,随机均分为4组:模型对照组不做任何治疗性处理;DMEM组行冠脉内注射DMEM液5mL;单纯细胞移植组行冠脉内注射骨髓间充质干细胞悬液5mL(1×107个细胞);AKT转染细胞移植组同法注射等量转染AKT1基因的骨髓间充质干细胞悬液。主要观察指标:载体酶切鉴定和测序验证结果,心脏磁共振检查评估心功能,免疫组化染色观察心肌组织学变化,ELISA法测定血清中血管内皮生长因子及转化生长因子β1的水平。结果:①双酶切鉴定和测序结果均表明所获取的cDNA为AKT1的CDS功能区基因;转染入293T细胞和骨髓间充质干细胞24,48h后,均可检测到强荧光出现;其蛋白表达产物的分子量与已知分子量相符,实时荧光定量检测结果表明转染2周后的骨髓间充质干细胞能稳定转录AKT1,其AKT1-mRNA的转录水平是原代细胞的120倍。②细胞移植前,梗死心脏的左室舒张末径增加,每搏量明显下降。与移植前比较,移植后单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组心功能明显改善,梗死区的收缩功能和血流灌注均有所改善,左室腔缩小,梗死区的毛细血管密度明显增加,且AKT转染细胞移植组上述各指标改善更为显著(P<0.05)。③苏木精-伊红染色结果显示,模型对照组、DMEM组梗死区纤维化明显;单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组梗死区均可见岛样心肌组织,且后者含有较丰富的小血管样结构。免疫组化染色结果显示,移植4周后单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组心肌切片中均发现有VWF及Cx-43阳性表达,且后组Brdu和Cx-43双阳性细胞占所有Brdu阳性细胞的比例明显高于前组(P<0.05)。④细胞移植后,血管内皮生长因子水平呈逐渐升高的趋势,1周后达峰值,后逐渐下降,至4周后接近正常水平;而转化生长因子β1水平呈逐渐下降的趋势,至4周后明显低于同期模型对照组、DMEM组(P<0.05),且明显低于移植前水平(P<0.05)。结论:使用携带目的基因AKT1的慢病毒系统转染猪骨髓间充质干细胞可使其长期稳定过表达AKT1,移植体内后可能通过防止梗死区变薄、抑制收缩功能异常而改善左室功能,同时AKT1的过表达可显著改善梗死后心脏功能。

摘要：目的探讨针对小鼠EOMA细胞核冈子KB（NF—KB）的小干扰RNA（siRNA）对细胞c}t组织因子（TF）表达的抑制作用。方法设计并化学合成针对小鼠NF—KBp65的siRNA，按照实验分组分别转染小鼠EOMA细胞，转染24h后，在相应细胞中加入肿瘤坏死因子α（TNF-α，终浓度为20mg／L），于此后6h分别提取各组细胞总蛋白及RNA，检测细胞内NF—KBp65蛋白表达和TF的mRNA水平。结果TNF-α．刺激6h后，与空白对照组相比，阴性对照组、scramblesiRNA组细胞内NF—KBp65蛋白表达和TFmRNA水半增加，而siRNA组则明娃受到抑制；TNF组、TNF＋scramblesiRNA组细胞内NF—KBp65蛋门表达和TF mRNA水平明显增加，TNF＋siRNA组细胞内NF—KBp65蛋白表达和TFmRNA水平较卒白对照组有所增加，但明显低下TNF纽、TNF＋scramblesiRNA组（P〈0．01）。结论利用siRNA抑制NF—KBp65蛋白表达可以有效地抑制NF—KB下游靶慕因TF的表达。