摘要：目的:观察密码子优化能否增强乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性。方法:根据乙型肝炎病毒(adr亚型)表面抗原中蛋白(MHBs)的氨基酸序列,在不改变其氨基酸序列的基础上,设计并人工合成了密码子优化的基因,并将该基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891中,构建了密码子优化的表达MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr/opt,简称opt)。用上述核酸疫苗与表达野生型MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr,简称adr)及空载体质粒pSW3891一起瞬时转染293T细胞,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中MHBs的表达。采用肌肉注射法,以opt、adr及pSW3891,分别对BALB/c小鼠进行免疫。用ELISA方法检测免疫后小鼠血清中HBs抗体的滴度,ELISPOT法检测免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞。结果:opt和adr均可在体外293T细胞中高效表达,且opt的蛋白表达量要高于野生型。opt免疫组小鼠特异性抗体滴度和免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ脾细胞数量都要显著的高于adr免疫组小鼠。结论:密码子优化可以增强乙型肝炎病毒DNA疫苗在体外的蛋白表达量及免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫原性。

摘要：目的:构建能表达密码子优化的中国HIV-1流行亚型AE、BC和B’gp120共识序列的核酸疫苗,并研究其免疫原性。方法:根据HIV-1的分子流行病学资料和包膜糖蛋白的氨基酸序列分析,设计了针对中国流行的AE,BC和B’(ThB)亚型的gp120共识序列。按哺乳动物细胞偏好的密码子对AE,BC和ThB3个亚型的gp120共识序列分别进行密码子优化,合成优化基因。将密码子优化的gp120基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891,构建重组质粒核酸疫苗。将重组质粒转染293T细胞,并以重组质粒疫苗免疫新西兰兔。应用蛋白质免疫印迹法检测转染细胞中gp120蛋白的表达。ELISA方法检测免疫后兔血清中gp120特异性抗体的产生。结果:3个密码子优化的gp120核酸疫苗,均能正确表达gp120。这些gp120核酸疫苗免疫家兔后,能产生HIV-1包膜糖蛋白特异性的抗体。结论:成功构建3个密码子优化的、表达HIV-1中国流行亚型AE,BC和ThB的共识序列的gp120核酸疫苗,能诱导HIV-1包膜蛋白特异的免疫反应。

摘要：目的建立和优化肝细胞内乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的检测方法。方法蛋白酶K裂解法释放肝细胞核内HBV cccDNA及基因组DNA,细胞裂解液进行核酸纯化后用酚-氯仿法抽提,并采用酶消化和设计特异性引物两种方法排除其他病毒复制中间体对检测结果的干扰,最后进行聚合酶链式反应(PCR)。结果以HBV松弛环状DNA(rcDNA)、阴性肝细胞、阴性血清作为对照,以包含HBV基因组全序列的质粒作为阳性对照,HBV感染者肝组织的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后出现的条带与目标片段分子量相等,且产物的DNA测序结果显示其序列与目标序列一致。外周血HBeAg(+)患者组肝组织检测结果的阳性率高于HBeAg(-)患者组。结论该方法检测肝细胞内cccDNA具有较高的特异性、敏感性,且成本较低。本方法临床标本初步检测结果显示病毒复制活跃患者肝组织中HBV cccDNA的阳性率较复制低的患者为高。

摘要：目的观察骨桥蛋白(OPN)RNA干扰(siRNA)在肝癌HepG2细胞中的沉默效应。方法设计合成骨桥蛋白RNA干扰寡核苷酸片段,将之克隆至pGCsi真核表达载体上,并经测序分析鉴定。用脂质体法将质粒转染HepG2细胞筛选稳定转染OPNsiRNA的细胞,并经Westernblot鉴定。结果成功构建3个pGCsiOPN质粒,瞬时转染293T细胞后发现pGCsiOPN2有干扰效应;进一步稳定转染肝癌HepG2细胞,筛选到4株阳性细胞克隆。结论OPNsiRNA在肝癌HepG2细胞中有沉默效应。