摘要：目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因沉默联合丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TanⅡA)对低氧条件下人肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制。方法依据人HIF-1α基因信息筛选RNAi有效靶序列,设计慢病毒载体引物并构建质粒,包装慢病毒表达载体,转染HepG2细胞,沉默低氧条件下HepG2细胞株中HIF-1α基因表达。将细胞分为正常对照组(野生型HepG2细胞)、干扰对照组(HepG2细胞转染NC-shRNA)、干扰组(HepG2细胞转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)加入培养液模拟肿瘤细胞低氧微环境,采用Western Blot检测各组细胞HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,采用CCK-8检测5 mg/L TanⅡA处理对低氧条件下各组细胞增殖活性的影响,采用Western Blot检测TanⅡA处理对各组细胞内p53和p21 CIP1/WAF1蛋白表达的影响。结果(1)HIF-1α-shRNA慢病毒载体包装成功且转染效率高,低氧培养各组细胞24 h后,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞中HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01)。(2)TanⅡA能时间依赖性抑制低氧条件下各组细胞增殖,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞增殖明显活性下降(P<0.01,P<0.05)。(3)低氧培养各组细胞24 h,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞中p53和p21 CIP1/WAF1蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。结论 HIF-1α基因沉默可增强TanⅡA对低氧HepG2细胞的增殖抑制作用,其机制可能与p53和p21 CIP1/WAF1蛋白水平上调有关。

摘要：目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/LCoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用WesternBlot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。WesternBlot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③WesternBlot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。