摘要：目的分析口腔鳞状细胞癌oralsquamouscellcarcinoma，OSCC）组织特征长链非编码RNA（***，lncRNA）表达谱，并探讨lncRNA结肠癌相关转录子2（coloncancerassociatedtranscript2，CCAT2）在OSCC中的表达及临床意义。方法采用高通量lncRNA芯片检测3例OSCC患者的癌组织及癌旁正常组织lncRNA表达水平，分析OSCC组织特征性lncRNA表达谱，进一步通过实时定量PCR（***，RT-qPCR）检测86例OSCC及对应的癌旁组织中CCAT2的表达，并分析其与临床病理特征关系。设计合成CCAT2的靶向小干扰RNA（CCAT2-siRNA），脂质体转染舌鳞状细胞癌Tea8113细胞。实验分为阴性对照组和CCAT2-siRNA转染组（实验组），利用CCK-8实验检测CCAT2干预对Tca8113细胞增殖能力的影响。结果OSCC患者癌组织与癌旁对照样本间差异表达的lncRNA共1685个，其中936个表达上调，749个表达下调，差异表达倍数≥10的lncRNA共23个。RT—qPCR验证结果显示，与癌旁组织相比，IncRNACCAT2在OSCC组织中高表达（平均上调5．7倍；P〈0．01）。临床病理相关分析显示，CCAT2表达水平还与OSCC的细胞分化程度及病理分期相关。低分化OSCC组织中CCAT2表达水平明显高于中、高分化OSCC组织（P=0．015）；TNM分期Ⅲ＋Ⅳ期OSCC组织的CCAT2表达水平明显高于Ⅰ＋Ⅱ期标本（P=0．022）。CCK-8实验结果显示，下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞CCAT2表达可明显抑制细胞增殖，转染48、72h实验组A值较对照组显著降低（P〈O．01）。结论多种IncRNA在OSCC患者肿瘤组织中呈异常表达，其中CCAT2在OSCC中的表达上调可能与OSCC的发生发展有关。

摘要：目的观察小鼠RAW264.7巨噬细胞不同极化状态下lincRNA-cox2表达变化，初步探讨lincRNA-cox2对巨噬细胞极化的影响。方法以IFN-γ/LPS刺激小鼠RAW264.7细胞诱导M1型极化，IL-4刺激RAW264.7细胞诱导M2型极化，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组细胞lincRNA-cox2的表达。设计并合成针对lincRNA-cox2基因的siRNA及无关序列，脂质体转染RAW264.7细胞，48 h后分别加入IFN-γ/LPS或IL-4继续诱导M1/M2型巨噬细胞，采用酶联免疫试验（ELISA）检测细胞因子IL-12及IL-10的分泌量；RT-PCR检测与巨噬细胞极化相关的iNOS、TNF-α、Arg-1、Fizz1的表达。将lincRNA-cox2-siRNA转染M1型巨噬细胞，检测其对M1极化表型的影响。结果RT-PCR结果显示，M1型巨噬细胞的lincRNA-cox2表达水平显著高于未极化细胞和M2型巨噬细胞。与对照组相比，lincRNA-cox2-siRNA转染RAW264.7细胞后，经IFN-γ/LPS诱导的M1型巨噬细胞中IL-12分泌降低，iNOS和TNF-α表达下降；而经IL-4诱导的巨噬细胞中IL-10产生增加，Arg-1和Fizz1表达升高。lincRNA-cox2-siRNA转染M1型巨噬细胞后，IL-12分泌降低，IL-10产生增加，其特点向M2样巨噬细胞转换。结论lincRNA-cox2参与调控小鼠巨噬细胞的极化，促进M1型巨噬细胞极化，抑制M2型巨噬细胞极化。

摘要：目的 构建以富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白（ TACO）基因为靶点的短发夹状RNA（ shRNA）表达慢病毒载体,鉴定其下调TACO表达的效果,以及对巨噬细胞吞噬和杀伤胞内结核分枝杆菌（ ***）的影响及相关机制. 方法 设计3条靶向小鼠TACO基因的shRNA表达片段及1条随机序列对照片段,插入慢病毒表达载体pSicoR 后利用293 T细胞进行病毒包装. 采用包装成功的慢病毒颗粒感染RAW264 .7细胞,分别采用real-time RT-PCR和Western blot方法鉴定干扰效果. 选择沉默效果最佳的重组慢病毒感染RAW264.7细胞,48 h后再采用***对这些巨噬细胞进行感染,倍比稀释培养法进行细胞内荷菌量的检测,免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞内***与溶酶体的共定位情况,cyto-ID细胞自噬检测试剂盒检测各组细胞的自噬水平,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达水平.结果 测序结果证实重组慢病毒表达载体均构建成功. 靶向TACO基因的3种重组慢病毒均可下调RAW264 .7细胞中TACO的表达,其中LV-pSRT1的效果最佳. LV-pSRT1感染组RAW264 .7细胞内的荷菌量在感染后0 h时即显著低于对照慢病毒（LV-pSRTc）感染组（5.50×104 vs 8.1×104, P〈0.05）. 以***感染后0 h时间点的细胞内荷菌量为基准,***感染后48 h和72 h时LV-pSRT1感染组RAW264.7细胞内*** 的存活率显著低于对照慢病毒感染组（48 h： 134.54% vs 213.58%, P〈0.05; 72 h：148.18%vs 262.96%, P〈0.05）. 与对照慢病毒感染组比较,LV-pSRT1感染组RAW264.7细胞内***与溶酶体的共定位率显著上调（75.67%vs 10.66%, P〈0.05）,同时细胞的自噬水平显著上调（16.20%vs 8.50%, P〈0.05）,LC3Ⅱ的相对表达水平也显著提高（0.51 vs 0.34, P〈0.05）. 结论 TACO基因特异性RNAi慢病毒表达载体可有效抑制RAW264.7细胞中TACO的表达,抑制巨噬细胞对***的吞噬能力,增强巨噬细胞对胞内***的清除能力. 下调TACO表达对巨噬细胞杀伤胞内***影响的机制与其通过自噬溶酶体途径提高***吞噬体与溶酶体的融合有关.

摘要：目的 探讨口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）中环状RNA circHIPK3的表达及临床意义,并探索circHIPK3调控微RNA124表达对OSCC细胞增殖的影响.方法 采用实时荧光定量PCR检测90例2016年1月至2017年5月于南昌大学第二附属医院的OSCC患者癌组织、配对的癌旁组织及OSCC细胞株CAL27、SCC15和人正常口腔角质细胞株hNOK中circHIPK3的表达水平并分析其与患者临床病理特征关系.设计合成circHIPK3的靶向小干扰RNA si-circHIPK3和阴性对照序列si-NC,分别转染CAL27和SCC15细胞,细胞计数（cell counting kit-8,CCK-8）检测circHIPK3对CAL27和SCC15细胞增殖能力的影响.实时荧光定量PCR检测微RNA 124在OSCC中的表达,分析circHIPK3的表达与微RNA124表达的相关性.CAL27和SCC15细胞分别转染si-circHIPK3和si-NC,实时荧光定量PCR检测细胞中微RNA124表达变化.CAL27和SCC15细胞分别转染si-NC、si-circHIPK3、微RNA 124模拟物、si-circHIPK3±微RNA124抑制物,CCK-8法检测OSCC细胞增殖的变化.结果 OSCC组织中circHIPK3表达水平[2.23（1.86,3.00）]显著高于癌旁正常组织[1.05（0.85,1.26）,U=1 094,P=0.000]. CAL27（3.02±0.51,P=0.000）和SCC15细胞（3.16±0.75,P=0.000）中circHIPK3表达水平均显著高于hNOK细胞（1.26±0.30）.circHIPK3在不同临床分期及不同细胞分化程度患者癌组织中表达差异均有统计学意义（P＜0.05）.抑制circHIPK3表达后,CAL27和SCC15细胞增殖能力受到明显抑制,差异均有统计学意义（P＜0.05）.OSCC组织中微RNA 124表达水平（0.61±0.35）较癌旁正常组织显著下调（1.13±0.39,t=-5.36,P＜0.05）.相关性分析显示OSCC组织中circHIPK3的表达与微RNA124呈显著负相关（r=-0.767,P＜0.001）.与沉默circHIPK3相比,在沉默circHIPK3的CAL27和SCC15细胞中加入微RNA 124抑制物共转染之后,沉默circHIPK3抑制细胞增殖的能力部分逆转.结论 OSCC中circHIPK3的表达水平上调,下调circHIPK3的表达水平可抑制OSCC细胞的增殖,circHIPK3可能通过调控微RNA124表达参与OSCC的发生和发展过程.

摘要：目的 构建一种可表达特异性10-23脱氧核酶（deoxyribozyme,DZ）的巨噬细胞靶向性细菌载体疫苗,并鉴定其在巨噬细胞表达10-23DZ的能力以及抑制靶基因表达的效果.方法 采用亚克隆方法将分枝杆菌复制子oriM克隆入10-23DRz真核表达载体pSDE01中,获取可在分枝杆菌和真核细胞中穿梭的重组质粒pSDE02.在前期研究基础上选择一有效的针对巨噬细胞taco基因的10-23DZ--DZ1,根据DZ1序列设计并制备DZ1的双链表达序列,插入pSDE02中获取重组质粒pDZM01.将pDZM01经电穿孔方法转化入耻垢分枝杆菌Ms1-2c株构建重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1.分别采用Ziehl-Heelson染色法和直接荧光观测法鉴定重组耻垢分枝杆菌的巨噬细胞靶向性.用rMS-DZ1感染巨噬细胞株RAW264.7,分别于感染后的24 h和48 h采用斑点杂交方法检测rMS-DZ1在巨噬细胞中表达DZ1的情况,再分别采取RT-PCR和免疫印迹方法检测巨噬细胞TACO表达的差异.结果 限制性内切酶酶切、菌落PCR及测序结果显示pSDE02、pDZM01和rMS-DZ1构建成功.rMS-DZ1感染RAW264.7细胞后24 h和48 h,经点杂交方法均检测到了DZ1的表达.半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果显示,与未感染组比较,rMS-DZ1感染后24 h和48 h时巨噬细胞TACOmRNA分别下降了67.90%和57.14%,TACO蛋白水平分别下降了53.85%和68.92%.同时,表达对照寡脱氧核糖核苷酸DZ1U的重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1U感染RAW264.7细胞后,其TACOmRNA和TACO蛋白水平与未感染组比较均无明显差异.结论 本研究成功构建了一种可表达特异性10-23DZ的巨噬细胞靶向性重组耻垢分枝杆菌的载体,可在巨噬细胞内表达并抑制相应靶基因的表达,可作为研制治疗用疫苗的基础,这也是国内外首次报道可表达10-23DZ的细菌性载体.