摘要：目的　构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法　参照GRA8序列分别设计引物 ,采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段 ,克隆至 pMD18-T载体 ;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析 ;各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX - 4T - 2和真核表达载体 pVAX1,分别转化大肠杆菌BL2 1和JM10 9,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列 ;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达 ;将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠 ,观察其诱导的抗体应答。结果　PCR扩增出GRA8基因的特异片段 ,各组阳性克隆的序列正确 ,并分别被亚克隆到原核表达质粒 pGEX - 4T - 2和真核表达载体pVAX1上 ,构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒 ;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白 ;真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论　以pGEX - 4T - 2和 pVAX1为载体 ,分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒。

摘要：目的克隆金黄色葡萄球菌野生株S407030肠毒素B(SEB)基因,并分析其分子特征。方法根据Genebank中金黄色葡萄球菌S6株肠毒素B基因设计1对引物,采用PCR法从金黄色葡萄球菌野生株S407030基因组中扩增目的基因,将目的片段与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB,并转化*** DH5a;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法作序列测定分析,并以ExPasy Proteoic Tools蛋白分析软件预测其编码SEB蛋白的二级结构。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约705bp的基因片段,所构建的阳性克隆重组子PCR及双酶切鉴定与预期结果一致;测序结果表明,克隆的SEB基因含705个碱基,与S6株序列相比无碱基的插入或缺失,同源性为98.4%;存在11个碱基变异,其中7个为无义突变,4个为有义突变(突变位点位于第364,699,899,988位,编码氨基酸变化分别为:Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser、Met→Leu);所预测的2菌株SEB蛋白的二级结构基本相同。结论本实验成功克隆了金葡菌野生株S407030SEB基因,其在不同菌株间相对保守;由SEB基因点突变引起的个别氨基酸的改变对SEB生物活性与毒力的影响有待进一步研究。

摘要：目的建立同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫的双重荧光定量PCR两步检测方法。方法针对蓝氏贾第鞭毛虫的gdh基因和微小隐孢子虫的cowp基因分别设计特异性引物和TaqMan探针。优化引物和探针浓度后,确定反应体系和反应条件,对其灵敏度、特异性、稳定性和重复性进行评价。通过与金标层析法进行医源性腹泻样本检测的比较评估该方法的实际应用价值。结果该方法能特异地检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,对其它非目标虫种均不产生扩增曲线,特异性良好。对阳性质粒pMDTM19-T-GIA和pMDTM19-T-CRY同时定量扩增的敏感度分别为45.1 copies/μL和52.8 copies/μL;阳性质粒标准品的标准曲线在109 copies/μL^101 copies/μL之间线性关系良好(R2=0.99),批内和批间重复实验的变异系数均小于5%。该方法与金标层析法具有较好的一致性。结论建立的双重荧光定量PCR两步法可快速、灵敏、特异地同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,具有较好的实际应用价值。

摘要：目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒***4,重组子在*** BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。

摘要：目的　探讨深圳地区苯丙酮尿症 (PKU)患者血苯丙氨酸羟化酶 (phenylalaninehydroxylase ,PAH)基因单核苷酸多态性位点。方法　设计 7对引物 ,应用多聚酶链反应 -单链构像多态 (PCR -SSCP)银染技术和DNA序列分析了 3个PKU家族共 13个成员的PAH基因。结果　PCR -SSCP分析发现 ,其中 2个家族的子女及其父母有电泳条带异常 ,测序结果示两多态性位点均在内含子 10上。结论　

摘要：目的建立利用核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)诊断性序列鉴别蚊媒的分子生物学方法。方法根据淡色库蚊、白纹伊蚊、嗜人按蚊rDNA-ITS2基因两侧的5.8S和28S保守区设计诊断性引物,进行3种蚊虫的rDNA-ITS2克隆鉴定,并利用其rDNA-ITS2特征进行现场蚊虫的鉴别。结果诊断性引物对于淡色库蚊、白纹伊蚊、嗜人按蚊DNA模板的扩增产物分别为440、514和558bp,3种蚊虫阳性克隆的测序结果与GenBank-blast相应蚊种rDNA-ITS2序列的同源性均为99%。用Biosept、DNAstar等软件分别分析发现各蚊虫克隆的个体间存在一定程度的单核苷酸多态性(SNP)。将现场采集的蚊虫诊断性引物扩增产物进行阳性克隆进行序列测定和分析,显示与淡色库蚊阳性对照的一致性为99%;与GenBank中淡色库蚊rDNA-ITS2基因的同源性为99%。结论通过对淡色库蚊、白纹伊蚊、嗜人按蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因的序列分析,表明3种蚊媒的rDNA-ITS2基因具有可鉴别的种属特异性。利用同一体系的共享引物扩增,可以建立适用于3种蚊媒的现场鉴定方法。

摘要：目的观察高度癌细胞表达1(Hec1)基因对肿瘤细胞分裂周期及其肿瘤形成的影响。方法利用RT-PCR、免疫荧光和Western blot从m RNA和蛋白质表达水平分析Hec1在小鼠实体瘤细胞和正常分化细胞中表达差异;应用RNAi技术设计靶向Hec1的sh RNA序列,在体外和体内沉默S180细胞中的Hec1基因,观察体外培养S180细胞和接种S180细胞小鼠肿瘤细胞内Hec1基因表达变化。结果 RT-PCR分析表明Hec1基因的m RNA在正常组织中不表达或极少表达,而在肿瘤组织和肿瘤细胞中高表达,免疫荧光和蛋白印迹表明Hec1蛋白在体外培养的S180细胞和实体肿瘤中高度表达,在正常组织中无表达;Hec1基因sh RNA干扰后,显著抑制了S180细胞中Hec1基因的表达,sh RNA干扰对小鼠肿瘤抑制率为63%,显著抑制S180细胞的分裂增殖。结论综上所述,Hec1在肿瘤细胞的分裂与增殖中起着重要的作用。

摘要：目的 克隆间日疟原虫MSP1C端编码基因,并进行序列测定和分析。方法 根据间日疟原虫MSP1C端编码基因设计1对引物,采用PCR技术从深圳间日疟患者血样(编号为PvSZ1)的核酸提取物中扩增出MSP1C端编码基因,回收纯化后,与T载体连接构建重组子pMD/MSP1,并转化大肠杆菌JM109。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后,双脱氧链末端终止法双向测定序列并分析。结果 从间日疟血样提取的DNA中扩增出1119bp的基因片段,所构建的pMD/MSP1阳性克隆重组子经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的间日疟原虫PvSZ1C端基因序列与国外Sal-1株比较,碱基数相同,未发现碱基缺失,相同的核苷酸占96.7％,序列中第542位碱基变化为同义突变(GTC→GTT,均编码缬氨酸),第375～542区间的碱基变化数占整个序列变化碱基总数的92.9％(34/37)。所推测的氨基酸序列与Sal-1株比较,同源性为92.5％。结论 成功克隆了间日疟原虫PvSZ1株MSP1C端编码基因,该基因在不同间日疟原虫地理株间相对保守,所克隆基因序列的第375～542核苷酸区域为高频变化区。

摘要：目的克隆和分析嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)第2内转录间隔区(ITS2)序列,研究嗜人按蚊rDNA-ITS2序列的种属特异性及不同个体rDNA-ITS2序列的单核苷酸多态性(Single Nuclear Polymorphism,SNP)。方法用DNA提取试剂盒从嗜人按蚊中提取DNA摸板,利用蚊虫5.8S和28S序列的保守性设计特异引物进行聚合酶链反应以扩增嗜人按蚊rDNA-ITS2基因,扩增产物经回收纯化后连接到TA载体,经amp+LB固体平板筛选的阳性克隆,经amp+LB液体培养基培养后进行PCR鉴定、EcoRI酶切鉴定和序列分析。结果经PCR反应扩增出全长556bp的嗜人按蚊rDNA-ITS2基因,纯化后重组克隆经PCR鉴定可重现556bp的特异性条带,其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同。嗜人按蚊6个克隆的同一性为99.6%,其rDNA-ITS2基因单核苷酸存在颠换和插入,在556的范围内有一个A→T,一个G→T的颠换;一个T的插入。结论嗜人按蚊rDNA-ITS2序列在种间高度保守,但不同个体间也存在一定的SNP多态性。

摘要：目的克隆恶性疟原虫海南株子孢子期小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）编码基因片段，分析其序列特征。方法根据恶性疟原虫基因库相关核酸序列设计1对引物，采用PCR方法从海南恶性疟患者血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrRNA基因片段，纯化后与pGEM-Teasy质粒连接，构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，采用BLAST软件分析其特征。结果恶性疟原虫子孢子期SSUrRNA基因扩增片段大小约为347bp；阳性克隆重组质粒双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段含有347个核苷酸，与GenBank中的恶性疟原虫3D7株相同序列进行比对，其同源性为100％，而与7G8株的同源性则为98．0％，其中第153位碱基发生了缺失，第184位碱基由C取代了T，而第188位T碱基与第189位A碱基为插入碱基，第243位碱基则由T取代了c。结论成功克隆恶性疟原虫海南株孢子期SSUrRNA编码基因序列，该序列相对保守，不同地理株间存在单核苷酸多态性。