摘要：目的在piggy Bac(PB)转座子介导下,探索在HepG2细胞中实现多个药物代谢酶稳定共表达的策略,为建立体外药物代谢和肝毒性研究的理想细胞模型奠定基础。方法首先选择3种目前针对大片段DNA使用较广的转染方法:Lipofectamine~?LTX,Gen Jet^(TM)(Ver.Ⅱ)和Neon~?Transfection System,分别转染N端标记增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)和2A串联重组细胞色素3A4(CYP3A4)和CYP2C19的PB转座子质粒(pPB-CYP3A4-2A-2C19)至HepG2细胞,48 h后比较不同方法的转染效率和细胞毒性,确立高效低毒的HepG2细胞转染方法。然后选择该法进行转染,将设计的3组PB重组转座子:单基因转座子(PB-CYP3A4)、2A串联多基因转座子(PB-CYP3A4-2A-2C19)、多个单基因转座子混合物[PB-CYP3A4,PB-CYP2C8,PB-CYP2A6,有机阴离子转运多肽1B1的PB转座子(PB-OATP1B1)]分别转染HepG2细胞,利用嘌呤霉素和GFP进行单克隆细胞筛选:挑选具有抗性且表达GFP的细胞单克隆并进行扩大培养,采用实时荧光定量PCR、Western蛋白质印迹和高效液相色谱-串联质谱联用法分别检测各组药物代谢酶m RNA、蛋白质水平及酶活性,并进行统计分析。结果 3种转染方法比较发现,Gen Jet^(TM)法的转染效率显著高于其他2种(P<0.01),介导pEGFP-N2和pPB-CYP3A4-2A-2C19的转染效率分别高达(94.2±2.5)%和(89.3±3.3)%,且该法具有较低的细胞毒性。因此选择Gen Jet^(TM)法进行后续PB转座子转染。分别转染3组PB重组转座子发现,单个转座子PB-CYP3A4和PB-CYP3A4-2A-2C19转染后,筛选获得的抗性细胞克隆中各个药物代谢酶在m RNA、蛋白质及活性水平均显著提高,其中2A可实现CYP3A4和CYP2C19药物代谢酶协同稳定表达;而多个转座子混合共转染细胞中,仅有随机几个基因表达;且各药物代谢酶基因的表达不均衡,仅CYP3A4药物代谢酶基因在单克隆细胞中表达水平明显升高。结论 Gen Jet^(TM)法可成为PB重组转座子转染HepG2细胞的有效方法。PB转座子可介导基因稳定表达;但在实现多基因共表达时,与病毒载体法不同,理论上可行的PB多转座子共转染方法其基因表达效率下降,且各基因表达不均衡。相比之下,应用2A串联多个基因串联重组PB单转座子可实现各基因稳定表达。

摘要：目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。

摘要：目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35 d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。

摘要：目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素(Leptin)成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列(GenBank号:GQ240885.1)和猪瘦素受体基因胞外域序列(GenBank号:AF167719.1)分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位(成熟肽编码区)和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌*** DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌*** BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21(DE3)中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。

摘要：目的:克隆西藏小型猪CYP3A基因并与人及其它小型猪品种进行序列比对分析。方法:根据Genebank数据库设计引物,取西藏小型猪新鲜肝脏组织,Trizol法提取肝脏总RNA,应用RT-PCR反转获得肝脏cDNA。分别扩增基因CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39,PCR片段回收后分别连接pMD-18T载体,获得重组质粒pT-CYP3A,阳性重组克隆送测序。采用NCBI Blast及vector NTI软件进行序列比对分析。结果:CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39基因编码序列全长1512 bp,编码503个氨基酸,与人CYP3A4相同。其中CYP3A22和CYP3A39与NCBI记录巴马小型猪序列相同;CYP3A46与巴马小型猪CYP3A46(NM_001134824.1)有6个位点碱基不同。CYP3A29与巴马小型猪CYP3A46(EU918131.1)亦有6个位点碱基不同。对来自2个母本后代猪的基因经过PCR扩增后测序发现CYP3A46、CYP3A29序列完全一致。结论:成功克隆西藏小型猪CYP3A的4个基因,其中CYP3A46与人CYP3A4的序列相似性最高。所得CYP3A46与CYP3A29序列可能为西藏小型猪独有。

摘要：目的:建立西藏小型猪CYP3A基因梯度PCR扩增方法。方法:以西藏小型猪肝脏总cDNA为模板,基于CYP3A46基因引物,对CYP3A46进行梯度PCR扩增(设计温度梯度55-65℃)。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得特异性好的最佳退火温度。结果:各退火温度均能特异的扩增出1500bp左右的目的条带。结论:本反应体系及各温度梯度均可特异性扩增西藏小型猪CYP3A46基因,为进一步克隆表达奠定了基础。