摘要：目的建立可模拟人类KRT14强致病位点突变的高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统。方法本研究通过检索多个数据库筛查人类单纯性大疱性表皮松懈症(EBS)致病的基因KRT14强致病突变位点,并通过人和小鼠KRT14蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上。根据CRISPR/Cas9系统的基因打靶原理,设计了4个靶向小鼠Krt14的单导RNA(sgRNA),并对应构建了4个sgRNA表达质粒。将sgRNA表达质粒分别与Cas9表达质粒共转染小鼠NIH 3T3细胞,转染细胞经过药物筛选、PCR扩增产物测序、TA克隆测序等实验验证4个sgRNAs的打靶效率。结果根据数据库筛查结果判定人KRT14蛋白的***125位点为强致病位点,与小鼠KRT14蛋白的***131位点相对应;根据小鼠***131位点的DNA序列,成功构建了4个靶向该位点的sgRNA表达质粒;药筛阳性细胞打靶位点的PCR扩增产物测序表明4个位点均发生了突变;TA克隆测序结果表明4个位点的突变效率分别为70%、90%、65%和100%。结论根据数据库筛查的人KRT14强致病位点,成功构建了高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统,为深入研究KRT14的功能以及建立KRT14基因编辑小鼠模型、探讨疾病的机制和治疗方法奠定基础。

摘要：为解决一次性刀叉注塑件开模后人工处理效率低下的问题,根据实际需求研制一款环形水口剪切装置与取料机械手协同作业,完成对环形注塑水口的剪切、刀叉收集以及残料分离等后处理工序内容.基于UG软件设计环形水口剪切装置的机械结构,制定水口剪切的工艺流程和控制方案,选择三菱FX1S系列PLC作为主控单元,利用GX-Developer编程软件设计顺序流程图及控制程序,研制了一种刀叉环形水口剪切装置,完善刀叉注塑流水线,大幅减少人工操作,提高生产效率,降低成本.