摘要：目的运用慢病毒载体系统构建人微小非编码RNA(miR-203)的重组慢病毒载体,并感染人慢性粒细胞白血病细胞(K562),观察其对K562细胞增殖与凋亡的影响。方法合成miR-203的前体序列,克隆至pLVX-IRES-ZsGreen1载体中构建成重组慢病毒质粒pLVX-shRNA2-miR-203(PremiR-203)。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体将其与包装质粒PLD2及包膜质粒PLD3共转染293T和K562细胞。荧光显微镜观察293T和K562细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达。QRT-PCR检测miR-203在K562细胞中的表达水平,MTT实验检测对K562细胞增殖的影响,流式细胞术分析细胞周期,TUNEL染色观察细胞凋亡形态。采用完全随机设计的单因素方差分析组间差异的显著性。结果经酶切鉴定和核酸序列测定,293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带miR-203基因的重组慢病毒,滴度为1.2×108 TU/mL。重组慢病毒感染K562细胞后,细胞中miR-203基因呈高表达;PremiR-203对K562细胞增殖抑制率24h为(8.10±0.15)%,高于阴性对照组的(5.16±0.14)%,F=3 499.1,P<0.001;48h为(32.4±0.49)%,明显高于阴性对照组的(6.4±0.19)%,F=9439.3,P<0.001;72h为(59.0±0.53)%,F=32 865.16,P<0.001。流式细胞术结果显示,细胞周期比例G1期为38%,S期为54%,G2期为8%。荧光显微镜观察到细胞核碎裂、核质固缩、细胞膜突出等典型的凋亡形态。结论成功构建重组慢病毒介导hsa-miR-203的表达载体,实现了其在细胞中的稳定表达,并有效抑制K562细胞增殖,并促进细胞凋亡。

摘要：目的研究原花青素联合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族成员Apollon小干扰RNA(small interfer-ence RNA,siRNA)对人肝癌(HepG2)细胞增殖、凋亡的影响。方法设计并合成Apollon siRNA的序列,将一定浓度的人工合成的Apollon siRNA经脂质体包裹转染肝癌(HepG2)细胞,运用实时荧光定量RT-PCR检测Apollon mRNA的表达水平,蛋白质免疫印记技术检测Apollon的蛋白表达水平,并筛选出Apollon siRNA的有效序列,并进一步联合不同浓度的原花青素作用于肝癌(HepG2)细胞48 h后,采用WST-8法检测单用Apollon siRNA、单用原花青素、及Apollon siRNA联合原花青素对肝癌细胞增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞早期凋亡率;Hoechst 33258染色观察HepG2细胞凋亡形态。结果设计的三对Apollon siRNA序列,筛选出其中有一对(NO.2)能明显下调Apollon mRNA与蛋白的表达水平,Apollon siRNA联合原花青素作用于HepG2细胞48 h后,单用原花青素的IC50为25.24 mg.L-1;Apollon siRNA与原花青素联合使用,原花青素的IC50为9.99 mg.L-1,增敏倍数为2.53,表现为协同作用。流式细胞术检测结果显示:Apollon siRNA联合原花青素能促进HepG2细胞凋亡,其早期凋亡率达25.2%;经荧光显微镜观察,Apollon siRNA组可见核高强度荧光的细胞,并见凋亡小体。结论 Apollon siRNA可增强肝癌细胞对原花青素的敏感性,作用机制可能为共同促进肝癌细胞早期凋亡有关,为临床上肝癌的治疗提供理论基础。

摘要：目的:观察抑制hsa-miR-204表达对人急性淋巴细胞白血病细胞(MOLT-4)生长与凋亡的影响。方法:设计合成hsa-miR-204的反义核苷酸序列(AMO-miR-204)并用脂质体转染法将其转染MOLT-4细胞。Q-PCR检测hsa-miR-204的表达量。噻唑蓝(MTT)试验和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞早期凋亡率。Transwell检测细胞侵袭能力。结果:AMO-miR-204可抑制hsa-miR-204的表达,以反义核酸浓度为0.6μmol/L时,下调最为明显(P<0.05)。MTT实验示AMO-miR-204的最佳转染抑制浓度为0.6μmol/L。AMO6组细胞平板克隆形成能力明显减弱[(29±8)%],差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测AMO6组细胞凋亡达(7.47%)。Transwell细胞侵袭能力实验示AMO6组细胞侵袭能力较其余两组减弱。结论:AMO-miR-204能有效抑制MOLT-4细胞的增殖,并促进其凋亡。hsamiR-204有可能作为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)基因治疗的靶基因,同时也为深入揭示ALL的发生和发展机制提供了实验依据。