摘要：目的:构建小鼠转化生长因子β1(TGF-β1)短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,探讨TGF-β1在血管发育中的调控作用。方法:根据GenBank小鼠TGF-β1mRNA序列,设计合成三对短链寡核苷酸,退火后形成双链DNA并克隆至入门载体pEN-mH1c。将插入目的基因片段的入门载体与带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的shRNA真核表达载体pDS-hpEy进行LR重组反应,完成三个TGF-β1shRNA表达载体的构建,分别命名为pDS-Ta,pDS-Tb和pDS-Tc。经测序确认后,转染小鼠成纤维细胞(NIH/3T3),筛选稳定表达的细胞克隆,以RT-PCR及Western blot方法检测转染后TGF-β1 mRNA和蛋白表达。结果:RT-PCR和Western blot显示pDS-Tc可明显下调NIH/3T3细胞TGF-β1的mRNA和蛋白表达,mRNA下调约为70%,蛋白表达减少约65%。结论:GFP标签TGF-β1shRNA表达载体能够阻断TGF-β1基因表达,可作为研究TGF-β1调控血管发育机制的一个工具,为阐明TGF-β1信号传导通路奠定基础。

摘要：背景:胚胎干细胞是平滑肌细胞重要的来源之一,但是胚胎干细胞分化细胞的异质性导致难以获得较纯的平滑肌细胞。目的:为进一步纯化胚胎干细胞来源的平滑肌细胞,拟在体外构建平滑肌特异性SM22α启动子驱动的嘌呤霉素抗性(puromycin acetyltransferase,pac)基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因双表达载体,即pSM22-PAC-IRES2-EGFP载体,并在胚胎干细胞中检测其有效性及特异性。设计、时间及地点:基因水平细胞观察实验,于2007-05/2008-09在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成。材料:小鼠胚胎干细胞系R1购自美国ATCC公司,编号SCRC-1011TM。pSM22α-EGFP载体由本实验室构建;pIRES2-EGFP载体、pSM2C载体、***载体购自Invitrogen公司。方法:用聚合酶链反应方法从pSM22α-EGFP中扩增SM22α启动子,然后用该启动子替换pIRES2-EGFP载体中的CMV启动子,构建pSM22-IRES2-EGFP。再从pSM2C中用HindⅢ/ClaⅠ酶切获得pac基因,将pac基因片段亚克隆到***中,构建pSuper-PAC。最后BgⅢ/AccⅠ双酶切pSuper-PAC获得pac基因片段,将其插入到pSM22α-IRES2-EGFP,构建成pSM22α-PAC-IRES2-EGFP。将pSM22α-PAC-IRES2-EGFP用脂质体法转染胚胎干细胞,G418筛选阳性克隆。诱导胚胎干细胞阳性克隆分化,RT-PCR扩增pac基因鉴定阳性克隆。对分化细胞行平滑肌细胞标志物SMα-actin免疫荧光染色。主要观察指标:①pSM22α-PAC-IRES2-EGFP测序结果。②pac基因扩增。③荧光显微镜下同时观察分化细胞EGFP的表达及SMα-actin染色情况。结果:HindⅢ/ClaⅠ双酶切得到261bp,664bp,5000bp3个片段,与预期结果一致,测序结果证实pSM22α-PAC-IRES2-EGFP构建成功。Pac基因扩增证实有4株胚胎干细胞克隆转染成功。转染成功的胚胎干细胞被诱导分化后,部分细胞表达EGFP,且这些细胞SMα-actin染色呈阳性。结论:实验成功构建了平滑肌细胞筛选载体pSM22α-PAC-IRES2-EGFP。成功转染这一载体的胚胎干细胞表达pac基因及EGFP基因,且EGFP表达具有平滑肌特异性。

摘要：背景:胚胎干细胞来源的平滑肌细胞是血管组织工程潜在的细胞来源之一,但这些细胞是否具有成熟平滑肌细胞的表型和功能仍不清楚。目的:对小鼠胚胎干细胞分化的平滑肌细胞进行表型鉴定及功能分析。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-05/2008-12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成。材料:清洁级孕12.5d昆明小鼠1只用于制备饲养层细胞,SD大鼠1只用于制备主动脉平滑肌细胞。小鼠胚胎干细胞系R1、小鼠微血管内皮细胞系由美国ATCC公司提供,转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1由本实验室制备。方法:①诱导分化及筛选:用转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1制备拟胚体,拟胚体悬浮培养5d后贴壁培养1d,第7天加入全反维甲酸诱导分化4d,第11天用10mg/L嘌呤霉素对诱导分化后的细胞筛选2d。②表型鉴定:对筛选到的平滑肌细胞进行SMα-actin、SM22α、SM-MHC免疫荧光染色,以大鼠原代主动脉平滑肌细胞、未经筛选的第10天分化细胞作为对照,进行WesternBlot分析。③收缩功能:10-5mol/L卡巴可处理筛选到的平滑肌细胞30min。④体外成血管功能:将等量的内皮细胞和筛选到的平滑肌细胞混合,在Matrigel上培养。主要观察指标:平滑肌细胞标志物的表达,平滑肌细胞的收缩,平滑肌细胞向内皮管腔样结构的募集。结果:分化的平滑肌细胞主要分布于贴壁生长的拟胚体的外周部位,胚胎干细胞来源的平滑肌细胞3种标志物SMα-actin、SM22α、SM-MHC免疫荧光染色均呈阳性表达,WesternBlot结果显示其SMα-actin、SM22α表达水平与大鼠原代主动脉平滑肌细胞相似,高于未经筛选的第10天分化细胞。筛选到的平滑肌细胞在10-5mol/L卡巴可刺激下出现明显收缩,且能够募集到内皮管腔样结构周围。结论:小鼠胚胎干细胞来源的平滑肌细胞具有与成熟平滑肌细胞相似的表型和功能。