摘要：目的　构建cag致病岛缺失的中国幽门螺杆菌 (H .pylori)突变株。为cag致病岛功能及H .pylori感染致病多样性机制的研究奠定基础。方法　运用基因重组方法将氯霉素抗性基因(CmR)连接到PCR扩增cag致病岛两端区域产生的 2个目的基因片段之间 ,并共同插入到pBluescriptSK( )载体的多克隆位点中 ,构建出带氯霉素抗性标志的缺失突变载体pBS cag mutant,将突变载体转化到含完整cag致病岛基因的突变受体H .pylori菌株中 ,根据同源重组原理 ,筛选出cag致病岛缺失的中国H .pylori突变株 ,并经PCR方法鉴定。结果　构建的突变载体经内切酶酶切分析显示 :产生的条带与设计结果完全一致。PCR方法扩增cagA、cagⅠ、cagⅡ、尿素酶等基因的结果显示 :筛选出的细菌为缺失cag致病岛基因的H .pylori菌株。结论　我们成功地构建出 1株中国人来源的、cag致病岛缺失的H .pylori突变株 ,对于阐明cag致病岛功能及其在H .

摘要：目的：确定人工设计的核酶Ｒｚ１９９对原癌基因Ｋ－ｒａｓｍＲＮＡ的体外切割活性，为Ｋ－ｒａｓ特异性核酶的体内应用提供依据。方法：利用ＤＮＡ重组技术构建Ｋ－ｒａｓ外显子１及核酶Ｒｚ１９９的体外转录质粒，以Ｔ７ＲＮＡ聚合酶进行转录获得核酶Ｒｚ１９９及其靶ＲＮＡ分子Ｋ－ｒａｓ外显子１ｍＲＮＡ，在含Ｍｇ２＋溶液中核酶Ｒｚ１９９对其靶ＲＮＡ分子进行切割。结果：Ｋ－ｒａｓ体外转录体为２５４ｎｔ的ＲＮＡ分子，能被核酶Ｒｚ１９９切割成大小分别为９０，１６４ｎｔ的２个片段。结论：核酶Ｒｚ１９９对Ｋ－ｒａｓｍＲＮＡ具有定点切割活性。

摘要：目的探讨^125I放射性胰管支架猪胰管内植入的可行性及安全性。方法将不同剂量的放射性胰管支架通过内镜植入猪胰管。术前、术后常规行血液学检查。术后14、30、60d分3批处死猪，观察腹腔有无炎症、渗出、穿孔、粘连等表现，并取胰腺、十二指肠、肝、胆管、肾等组织行病理检查。结果14头猪通过内镜成功植入胰管支架。在相邻脏器如十二指肠、胃、肝和右肾未发现渗出、出血和坏死。在治疗组，胰管壁正常形态结构消失。组织学检查发现支架周围依次为坏死组织和纤维化组织。在随访期间，外侧的纤维化组织的宽度逐渐增加。支架植入后血液学检查未发现明显异常。结论本研究显示，在所有剂量组放射性支架植入是安全的，提示在今后的临床应用中，按照肿瘤的大小、形态和位置的差异设计特定的放射性胰管支架姑息性治疗胰腺癌是可行的。

摘要：目的利用pGCsi—U6-GFP质粒构建干扰人转录因子GLI1基因的小发夹RNA（shRNA）表达载体，并进行干扰活性鉴定。方法根据GenBank中GLI1cDNA的序列，设计并合成3条GLI1siRNA，分别克隆至质粒载体pGCsi-U6-GFP中构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5a，扩增后提取质粒，行PCR及测序鉴定。脂质体转染法将鉴定正确的3个重组质粒pGCsi—U6-GLI1siRNA-1、pGCsi—U6-GHlsiRNA4、pGCsi—U6-GLI1siRNA-3及作为阴性对照质粒的pGCsi—U6-GLI1siRNA—C分别与过表达质粒pEGFP—N1-GLI1共转染HEK293细胞株，48h后收集细胞，半定量RT—PCR及蛋白质印迹法检测各组细胞GLI1mRNA及蛋白的表达，鉴定筛选出最佳干扰质粒。结果3个重组质粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi—U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3均扩增出预期大小（369bp）的片段，经测序证实与设计合成的序列完全一致。3个重组质粒转染HEK29细胞后细胞GLI1mRNA表达量分别为0．290±0．011、0．421±0．018、0．373±0．018，蛋白表达量分别为0．318±0．026、0．433±0．021、0．381±0．018，均显著低于阴性对照质粒转染细胞的0．834±0．022及0．818±0．024（P=0．000）。GLI1mRNA表达抑制率分别达65．8％、50．7％、55．7％，蛋白表达抑制率分别为63．9％、48．3％、53．9％，以pGCsi-U6-GLI1siRNA．1的干扰作用最强。结论成功构建了靶向GLI1的shRNA表达载体，筛选出具有最佳干扰效果的质粒，为进一步研究GLI1基因功能奠定了基础。

摘要：目的观察DNA甲基转移酶1（DNMTl）基因沉默后对人胰腺癌PaTu8988细胞的DNMT活性及hMLH·1基因CpG岛DNA甲基化状态的影响。方法由美国Ambion公司设计合成DNMTIsiRNA和阴性对照siRNA，分别用15、30nmol／L的浓度转染胰腺癌PaTu8988细胞，以未转染组细胞作为对照。应用实时PCR和蛋白质印迹法检测DNMTlmRNA和蛋白的表达；用DNMT活性检测试剂盒检测其活性；用亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）法检测hMLH-1基因CpG岛的甲基化状态；实时PCR法检测hMLH-1mRNA的表达。结果转染48h后，DNMTlsiRNAl5、30nmol／L组细胞DNMTlmRNA表达量分别为0．573±0．026和0．143-3-0．044，显著低于对照组的1．020±0．217及阴性siRNA15、30nmol／L组的0．900±0．475和0．938±0．327（P值均〈0．05）；DNMTlsiRNA组的DNMTl蛋白表达亦低于对照组和阴性siRNA组。DNMTlsiRNAl5、30nmol／L组细胞DNMT活性分别为0．364±0．124和0．250±0．072，明显低于对照组的0．931±0．065及阴性siRNA15、30nmol／L组的0．665±0．055和0．472±0．040。DNMT活性与DNMTlmRNA表达呈正相关（r=0．69，P〈0．01）。DNMTlRNA干扰后导致hMLH-1基因CpG位点的8个甲基化减少到1个甲基化。结论DNMTlsiRNA能特异性抑制胰腺癌PaTu8988细胞DNMTl基因的表达，明显抑制DNMT的活性，并引起hMLH-1基因CpG岛去甲基化。

摘要：目的观察以DNA甲基转移酶1（DNA methy transferas 1，DNMT1）基因为靶基因的RNA干扰对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖及凋亡的影响。方法设计、合成针对DNMT1基因的siRNA和阴性对照siRNA（N—siRNA）。实验分为空白对照组、脂质体组（仅予脂质体）、N—siRNA组（转染30 nmol N-siRNA）、siRNA组（转染30 nmol siRNA）。siRNA转染48h后，实时PCR法检测DNMT1 mRNA水平；WST-8法检测细胞增殖；流式细胞技术检测细胞凋亡。结果siRNA组DNMT1mRNA的抑制率为（86．0±4．3）％，明显高于N—siRNA组的（40．1±2．2）％和空白对照组的0（P〈0．01）；细胞存活率为（47．6±5．6）％，明显低于N—siRNA组的（68．1±4．1）％和空白对照组的100％（P〈0．01）；细胞凋亡率为（14．94±2．89）％，明显高于空白对照组的（7．51±1．12）％、脂质体组的（7．06±0．39）％、N—siRNA组的（8．84±1．44）％（均P〈0．01）。结论siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1 mRNA的表达，同时抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。