摘要：为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的重组突变体,并评价其毒力和免疫原性,对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56位和第130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变。此外,在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNCPAm4。将GTFNCPAm4克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTF_NCPA_(m4)。利用Western blot方法检测rTF_NCPA_(m4)与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并检测该蛋白的卵磷脂酶和溶血活性以及对小鼠的毒力。随后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化,免疫家兔,检测兔血清的中和抗体效价。二免后21 d,对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rTF_NCPA_(m4)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rTF_NCPA_(m4)主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素产生血清反应;体外实验显示,rTF_NCPA_(m4)无卵磷脂酶和溶血活性;小鼠安全性实验显示,5.5 mg/kg剂量的rTF_NCPA_(m4)对小鼠无致死性;免疫重组蛋白后,每毫升的一免抗血清可中和10个MLD、二免抗血清可中和40个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上数据说明,表达的CPA重组突变体蛋白具有良好的安全性和免疫原性,为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的实验数据。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体p Cas-g RNA和同源重组供体DNA载体p Back Zero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成c DNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平。结果:g RNA表达质粒p Cas-g RNA和DNA供体质粒p Back Zero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达。细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱。q RT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化。结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达。

摘要：目的:探索并构建肾肿瘤行肾部分切除术的CT三维可视化术前评估系统及其应用价值。方法:回顾性收集北京大学第一医院泌尿外科因肾肿瘤行肾部分切除术患者的临床资料做初步探究,同时收集我国16家临床中心因肾肿瘤行肾部分切除术患者的同质化标准数据,应用CT三维可视化系统(IPS系统,Yorktal)评估肿瘤解剖结构、血供等信息,通过归纳和总结构建评估系统,完成虚拟手术设计及术中辅助导航,指导临床手术。结果:基于泌尿系增强CT建立三维可视化图像,评分系统纳入肿瘤最长径和体积、肿瘤侵入实质内体积占比、肿瘤侵入实质最大深度、肿瘤与肾实质接触面积、肿瘤肾实质接触面平整度、肿瘤所在肾脏分段位置、肾血管变异情况及肾周脂肪。肿瘤平均二维直径为(2.78±1.43)cm,平均三维最大径为(3.09±1.35)cm,术后病理平均大小(3.01±1.38)cm。三维重建肿瘤最大径与术中肾动脉阻断时间延长、术中出血量显著相关(r=0.502,P=0.020;r=0.403,P=0.046)。三维重建及病理肿瘤体积分别为(25.7±48.4)cm3、(33.0±36.4)cm3(P=0.229),三维重建肿瘤体积与术中出血量显著相关(r=0.660,P<0.001),肿瘤侵入肾实质内体积占比与术中肾动脉阻断时间延长、术后并发症的发生显著相关(r=0.410,P=0.041;r=0.587,P=0.005)。肿瘤与肾实质接触面积及是否存在血管变异与围手术期指标及术后并发症未见相关性。完成术前评估的同时,重建后的三维影像可在Touch Viewer系统上进行缩放、旋转、组合显示、颜色调整、透明化、长度体积自动测量及模拟裁切等操作,满足术前虚拟手术规划及术中辅助导航的要求。结论:三维图像可提供更加直观的解剖结构,清晰显示肿瘤解剖参数及血供、脂肪等信息,CT三维重建肾肿瘤评价系统可帮助预测肾部分切除术手术难度、围术期并发症等。重建的三维可视化图像导入指定程序或机器人操作系统即可完成虚拟手术及术中辅助导航,帮助手术医师更好地把握手术过程。评分系统所包含的指标及各项指标的分值权重需要通过多中心大样本的研究来证实及完善。

摘要：为获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,并将第106位组氨酸突变为脯氨酸,经人工合成获得基因片段GETXH106P。将GETXH106P克隆至原核表达载体p ET30a(+),转染BL21(DE3)菌中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白r ETXH106P。利用Western blot方法检测r ETXH106P与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)以及小鼠的毒力。随后,将r ETXH106P与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果表明,r ETXH106P为可溶性表达,通过灰度扫描,其可溶性表达量比例可达30%;该重组蛋白能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;细胞毒性试验结果显示,100μg/m L的重组蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性实验结果显示,6.25×106ng/kg剂量的重组蛋白对小鼠仍无致死性;每毫升的一免抗血清可中和450~700个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和3000~4000个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1 MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。以上结果表明,产气荚膜梭菌r ETXH106P重组蛋白毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。

摘要：为获得对猪具有免疫刺激活性的含CpG序列的重组质粒,设计合成了11条CpG序列,应用MTS比色法测定合成CpG ODNs刺激猪PBMC增殖的能力,结果有10条CpG ODN对猪PBMC具有刺激活性(SI>2);以对猪PBMC具有较高刺激活性的CpG06和CpG08为核心,分别合成含6次重复序列的重组质粒pCpG06和pCpG08,并检测其对猪PBMC的刺激活性,结果重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC的刺激指数分别可达4.97和5.32,并可刺激猪PBMC产生较高水平的IL-4。研究获得的重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC具有较好的刺激活性,可为猪用CpG佐剂的研究提供参考。

摘要：目的:比较体部伽玛刀与高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound HIFU)治疗门静脉癌栓(portal vein tumor thrombosis PVTT)的有效性,探讨其临床应用价值。方法:2006年6月至2008年6月的原发性晚期肝癌合并门静脉癌栓的患者分为两组,38例采用体部伽玛刀治疗,计划设计3-10个靶点,单次剂量3-6Gy,2-5F/wk,照射总量30-50Gy。治疗计划中≥50%的等剂量曲线包绕计划靶区(PTV)。40例采用高强度聚焦超声治疗,对门静脉主干或(和)第1级分支内癌栓进行HIFU治疗3-7次,观察治疗后门静脉癌栓的变化、肝功能腹水的改善及患者的生存情况。结果:治疗后1月评价疗效,伽玛刀组癌栓完全消失(CR)8例(21.1%),部分缓解(PR)10例(26.3%),无变化(NC)20例(52.6%);HIFU组完全消失7例(17.5%),部分缓解14例(35.0%),无变化19例(47.5%)。两组总有效率(CR+PR)比较无显著差异性(P=0.702)。治疗后两组患者肝功能和腹水均有不同程度的改善。随访时间6-30个月,伽玛刀组死亡19例,中位生存期11个月;HIFU组死亡22例,中位生存期10个月。结论:体部伽玛刀与HIFU治疗门静脉癌栓疗效相似,均安全、无创伤、痛苦小。

摘要：目的:探讨RNA干扰(RNAi)后对大鼠T淋巴细胞共刺激分子CD28基因的表达及其对细胞功能的影响。方法:设计针对目标基因的小干扰RNA(siRNA),转染大鼠T淋巴细胞。以FCAS检测CD28水平,MTT检测转染后T淋巴细胞对异体淋巴细胞增殖能力的影响,Realtime-PCR及ELISA法检测细胞因子水平。结果:siRNA转染大鼠T淋巴细胞后可抑制CD28的表达,T细胞增殖能力、IL-2、IFN-γ水平明显低于空白对照组(P<0.05)。结论:siRNA可特异性抑制大鼠T淋巴细胞共刺激分子CD28的表达,降低大鼠T细胞的增殖能力,抑制IL-2、IFN-γ细胞因子的基因水平表达和分泌水平,从而产生免疫耐受效应,为器官移植免疫研究提供实验依据。

摘要：目的 :研究中度高原地区 (15 17m)胸部手术前后多脏器功能指标的动态变化。方法 :选择拟行食管癌手术患者 2 0例 ,根据设计 ,对多脏器评分要求的 33项指标进行手术前后动态观察。通过对MODS多器官功能指标标准、APACHEⅡ评分系统、SIRS标准等进行统计学分析 ,对比手术前后各相关器官指标的变化和全身炎症 /应激反应的水平。结果 :血气指标变化幅度较大 ,PaO2 /FiO2 、AaDO2 与术前相比P <0 .0 1,术后第 1、3、5天符合SIRS 2～ 4项标准依次为 10 0 %、90 %、6 0 % ;术后第 1、2天全部达到ALI标准 ,术后第 1、3、5天达到ARDS血气指标的依次为 95 %、80 %、5 0 % ;按庐山会议标准多脏器功能损伤可满足 2～ 4个器官评分标准的第 1、3、5天依次为 9例 (45 % )、8例 (40 % )和 10例 (5 0 % ) ;血小板计数、谷草转氨酶、Na+ 、血糖等器官功能指标术后第 1、3、5天与术前相比P <0 .0 5 ,P <0 .0 1。结论 :中度高原地区胸部手术后对多个器官功能指标影响较大 ,所有病例均可满足SIRS和ALI、ARDS血气标准 ,半数病例达到轻度MODS标准。表明平原ARDS/MODS标准不适用于中度高原地区 ,有必要对诊断标准和海拔高度作出适合实际的界定。

摘要：H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是我国主要流行的低致病性禽流感病毒亚型，因而对其进行病毒的监测与诊断显得极其重要。通过比对GenBank上H9亚型禽流感病毒HA基因序列,设计了一个特异性针对H9 AIV HA的探针。特异性和扩增曲线实验结果显示，该探针具有较好的扩增效率，且仅特异性识别H9亚型AIV。通过重组质粒pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板，进行荧光定量PCR。实验结果表明，本研究所建立的荧光定量PCR方法敏感性能达到100个DNA拷贝数，比传统PCR方法检测敏感性提高了1000倍。此外，本方法还能检测到10EID50个病毒，比传统PCR方法检测敏感性也提高了1000倍。通过批间和批内试验，结果表明，这两个试验的变异系数分别小于5%和1%，说明本研究的方法具有较好的重复性。此外，通过检测人工感染动物咽拭子，结果表明H9亚型AIV荧光定量PCR方法比传统PCR的方法检测敏感性提高了100倍。在临床样品的检测中，H9亚型AIV荧光定量PCR方法检测的阳性率比传统PCR法检测的阳性率提高了大约30%。综上所述，本研究所建立的H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确性和敏感性，对H9亚型禽流感疫情防控及其流行病学调查具有积极的科学意义。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。