摘要：背景：利用转基因技术诱导皮肤真皮成纤维细胞分化为特殊器官组织功能的前驱细胞具有重要意义。目的：观察肌肉转录调节因子（myogenic determination，MyoD）基因转染对大鼠真皮成纤维细胞生物学特性的影响。设计、时间及地点：单一样本观察，细胞基因工程学实验，于2005-01／2007—02在同济大学附属东方医院心胸外科和细胞治疗室完成。材料：清洁级雄性SD大鼠6只，购自上海西普尔．必凯实验动物有限公司。Ⅱ型胶原蛋白酶为GIBCO公司产品，稻瘟菌素粉剂为美国Promega公司产品，慢病毒载体pLenti6／V5-DEST为Invitrogen公司产品，BrdU为美国Sigma公司产品。方法：无菌条件下切取大鼠腹侧全层皮肤，采用200IU／mL的Ⅱ型胶原蛋白酶在4℃下解离大鼠皮肤真皮组织，组织块培养法获取贴壁的真皮成纤维细胞，待生长近融合状态时传代扩增。取传至第3-6代细胞，利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6／V5-DEST-MyoD进行转染，经终浓度为50mg／L稻瘟菌素筛选后，挑选转基因单克隆细胞传代培养，向细胞培养液中加入10μmol／L BrdU于37℃条件下孵育48h。主要观察指标：细胞形态学观察，免疫细胞化学染色鉴定，体外BrdU标记情况。结果：体外分离培养的真皮成纤维细胞纯度高，形态良好，生长增殖功能正常，转染后经稻瘟菌素筛选2周即可见克隆形成。光镜下真皮成纤维细胞免疫细胞化学染色后波形蛋白呈阳性表达，转染MyoD基因后肌动蛋白亦呈阳性表达。10μmol／LBrdU孵育48h的标记率〉98％，且连续传代5次后仍可检测到BrdU阳性细胞。结论：真核表达载体成功介导MyoD基因转染体外分离培养的大鼠真皮成纤维细胞，并诱导其转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞，可在体外稳定生长扩增。

摘要：背景:研究表明基因工程将成纤维细胞改造为可兴奋细胞是可能的;而真皮成纤维细胞是机体内数量最大的"种子细胞库"。目的:观察肌肉转录调节因子(myogenic determination,MyoD)和连接蛋白43(connexin43,Cx43)基因共转染真皮成纤维细胞后在心肌梗死部位原位移植对急性心肌梗死大鼠血浆脑钠素浓度和心肌梗死面积的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/2007-03在同济大学附属东方医院细胞治疗室和上海中医药大学动物实验中心完成。材料:雄性SD大鼠60只随机分成正常对照组、心肌梗死对照组、正常移植组和心肌梗死移植组,每组15只。方法:结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。4周后再次开胸在自结扎远端紧靠结扎处,心肌梗死区与非梗死区交界处用微量注射器将100μL经BrdU标记的MyoD/Cx43-FB细胞悬液(细胞数1.0×106)注入左冠状动脉前降支,在结扎远端已缺血的心肌上用同样的针头于靠近心尖部、室间隔部、左室前侧壁缺血的心肌上多点多位置将另外100μL移植细胞悬液注入到心肌内,深度约4mm;对照组同法等量注入未含细胞的DMEM细胞培养液。主要观察指标:细胞移植前和移植后1d,1,2,4周动态检测血浆脑钠素浓度;同时监测各组大鼠心率、动脉压、左心室内压及左心室等容收缩期室内压最大上升速率和下降速率等血流动力学指标的变化;4周后处死大鼠取心肌标本染色后测定心肌梗死面积。结果:①免疫组织化学检测结果显示心肌瘢痕区边缘有BrdU阳性细胞存在。②细胞移植可显著改善心肌梗死大鼠的血流动力学。③心肌梗死对照组和心肌梗死移植组大鼠的血浆脑钠素浓度较正常对照组和正常移植组明显升高(P<0.01);在移植后1d、1周、2周心肌梗死移植组与心肌梗死对照组血浆脑钠素浓度差异无显著性意义,4周后明显降低(P<0.01)。④心肌梗死移植组的梗死面积显著小于心肌梗死对照组(P<0.01)。结论:MyoD和Cx43基因联合转染成纤维细胞后原位移植修复坏死心肌组织,能减小梗死面积。

摘要：目的:在靶向克隆酶的作用下,利用PCR靶向克隆构建携带人神经生长因子的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP。方法:按PCR引物设计原则设计两条引物,分别在上下游引物的5′端加上12个碱基与线性化载体切口两端同源载体序列,引物合成后PCR反应扩增目的基因hNGF-β,提纯后与EcoRⅤ酶切的穿梭质粒pShuttle-IRES-hrEGFP在靶向克隆酶(LPReccoenzyme)的作用下37℃孵育15min,转化感受态大肠杆菌,碱裂解法制备及纯化质粒DNA。结果:EcoRⅤ酶切鉴定证实pShuttle-hNGFβ-EGFP构建成功。结论:在不需要限制性内切酶的情况下用靶向克隆酶连接可快速、准确得到穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP。