摘要：为建立一种可降低PCR假阴性的槟榔隐症病毒(areca palm velarivirus 1,APV1)检测方法,参考已报告的槟榔引物保守基因,设计槟榔内标准物引物和APV1引物,槟榔内标准物引物合成3对,APV1引物合成2对,进行PCR扩增筛选槟榔内标准物引物和APV1引物。运用双重PCR扩增方法,优化反应参数。内标准物引物和APV1引物的最适引物浓度比为1:4,内标准物引物终浓度为0.2μmol/L,APV1引物终浓度为0.8μmol/L,最适退火温度为54℃,最适循环次数为30次。灵敏度结果表明,槟榔cDNA浓度稀释到10^(-6)时,仍能扩增出目的条带。特异性结果显示,只有槟榔能检测到内标准物和APV1扩增出的目的条带。利用建立的双重PCR检测方法,对海南省万宁市的40份槟榔样品进行了检测,发现有25份样品感染APV1。本研究结果可为降低槟榔潜隐病毒PCR假阴性提供理论依据。

摘要：为了筛选出合适的抗生素种类和浓度作为遗传转化体系的抗性筛选剂,本研究以卡那霉素、遗传霉素(G418)、潮霉素B、草甘膦作为筛选剂,对椰枣愈伤组织进行敏感性试验。以椰枣茎尖生长组织为外植体诱导出的愈伤组织为实验材料,分别设计卡那霉素、遗传霉素(G418)、潮霉素B、草甘膦4种筛选剂不同浓度梯度,研究负筛选剂卡那霉素、遗传霉素(G418)、潮霉素B、草甘膦对椰枣胚性愈伤组织的致死浓度、半致死浓度及时间,确定愈伤组织对筛选剂的敏感性,为建立椰枣负筛选系统的遗传转化体系提供基础。结果表明:(1)椰枣愈伤组织对筛选剂的敏感度:G418>潮霉素B>卡那霉素>草甘膦。(2)50 mg/L的G418浓度适合作为椰枣遗传转化体系中的抗性筛选剂。(3)50 mg/L的潮霉素B浓度适合作为椰枣遗传转化体系中的抗性筛选剂。(4)100 mg/L的卡那霉素浓度适合作为椰枣遗传转化体系中的抗性筛选剂。(5)椰枣对草甘膦不敏感,不适用作为遗传转化的抗性筛选剂。综上所述,G418和潮霉素B更适合作为椰枣遗传转化体系过程中的抗性筛选剂。

摘要：槟榔黄化病是由植原体引起的致死侵染性病害,严重制约海南省槟榔产业发展。为了提高槟榔黄化植原体的检测效率,本研究设计了新的巢氏PCR引物:F4/R1和F2/R2,并利用该引物检测海南省300份槟榔黄化叶部样品,其中184份呈阳性,比植原体通用引物(R16mF2/R16mR1和R16mF2n/R16mR2)检测率提高了58.00%。利用新引物首次在槟榔种果中检测到植原体。将本研究扩增的约1.2 kb的特异性片段测序,并进行序列比对和系统进化树分析。结果显示,该槟榔黄化植原体属于16SrI组,且与16SrI-M序列完全一致。此外,本研究所测序的槟榔黄化植原体(GenBank登录号:MZ971180)与已知的海南省槟榔黄化植原体(GenBank登录号:FJ694685;FJ998269)分别存在两个碱基差异,序列一致性为99.80%。本研究为槟榔黄化病诊断及防控提供理论依据。

摘要：植物WRKY转录因子可参与植物对重金属离子的胁迫响应过程,木薯MeWRKY12基因表达受到镉(Cd)、铅(Pb)离子胁迫诱导。本研究利用在线软件CRISPR-P v2.0设计了MeWRKY12基因的编辑靶点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1301-Cas9-MeWRKY12-sgRNA,并将该载体转化、侵染木薯脆性胚性愈伤组织。PCR扩增基因靶点及潜在的脱靶位点区域序列,并进行Sanger测序分析序列变化情况。结果表明,MeWRKY12基因被成功编辑,且没有脱靶现象。本研究有助于进一步获得MeWRKY12基因突变体,为解析MeWRKY12转录因子调控木薯响应Cd、Pb胁迫的分子机理打下基础。

摘要：油棕核壳厚度性状是影响油棕单株棕榈油产量的重要因子。SHELL基因是控制油棕核壳厚度性状的关键基因,其显隐性与核壳厚度性状类型高度相关。本研究根据已发布的油棕SHELL基因序列中的SNP位点,设计了一对特异性CAPS引物和限制性酶切位点,利用该标记对18份已知三种核壳厚度类型油棕叶片的基因组DNA进行PCR扩增和酶切检测,随后在70份油棕材料中进行验证。酶切结果表明,厚壳型油棕酶切产物包含2条条带(280和250 bp);无壳型油棕酶切产物包含1条条带(550 bp),与酶切前无差异;薄壳型油棕酶切产物包含3条条带(550,280和250 bp)。油棕核壳厚度性状类型分子鉴定结果与田间调查结果相一致。本研究利用基于油棕核壳厚度控制基因SHELL的CAPS分子标记方法,能准确鉴别厚壳型(Dura)、薄壳型(Tenera)和无壳型(Pisifera)三种核壳厚度类型的油棕材料,为油棕育种材料的早期鉴定与选择、提高杂交育种效率提供了有效途径。

摘要：为了克服传统的基因电子克隆利用EST数据库需要反复比对与拼接而带来的繁琐,本研究利用SRA、TSA等数据库,通过BLAST搜索同源序列,Serial cloner软件寻找同源序列的开放阅读框架,CLUSTAW比对序列同源性等分析手段,建立了一种基因电子克隆的新方法。通过此方法,获得了芒果无色花青素还原酶(leucocyanidin reductase, LAR)基因的编码序列。根据此编码序列、设计引物,通过RT-PCR扩增,获得了长度为1 062 bp的芒果LAR基因序列,经双酶切、连接等方式,构建了含有LAR基因的重组植物表达载体pMAA-RedMilar。本研究结果将有助于进一步解析芒果LAR基因在原花青素生物合成中的作用,也为其他基因的电子克隆提供了新方法。

摘要：斑茅是甘蔗近缘野生种之一,具有较强的抗逆性,研究并开发利用斑茅的强抗逆基因,对甘蔗育种具有重要意义。本研究以高粱Cu/Zn-SOD(登录号:XM 002445626.1)cDNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行检索、比对、拼接,通过设计特异引物,PCR扩增和序列分析验证,克隆得到2个Cu/Zn-SOD(SaSOD-1a和SaSOD-1b,登录号:KJ001795和KJ001796)基因全序列,其中SaSOD-1a基因组序列全长2 473 bp,SaSOD-1b基因组序列全长2 228 bp,均有8个外显子,7个内含子,其cDNA序列长度均为692 bp,编码206个氨基酸。序列比较分析表明,SaSOD-1a和SaSOD-1b序列相似性为98.6%,有8个单核苷酸多态性位点,蛋白质相似性为99.0%,2个氨基酸变异位点。用推导出的氨基酸序列与其它植物做同源进化分析,与高粱、玉米、谷子等比较均表现出较高的保守性。研究结果可为进一步了解超氧化物歧化酶与斑茅耐旱性的关系奠定基础。

摘要：类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenases,CCD)是植物类胡萝卜素新陈代谢中的降解酶,类胡萝卜素在双加氧酶的作用下氧化产生具有生物活性的不同衍生物,例如维生素A,植物激素脱落酸以及芳香物质,这些物质在植物的颜色、苦味、香气方面具有重要意义。通过转录组数据设计CCD1基因的全长引物,采用RT-PCR技术从芒果(Mangifera indica)果皮中克隆到类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD1的全长序列。结果表明:c DNA序列长度为1 900 bp,开放阅读框为1 614 bp,共编码537个氨基酸。CCD1蛋白属于稳定蛋白,在CCD1编码的蛋白质的氨基酸各组分中,亮氨酸(Leu)含量为最高,缬氨酸(Val)的含量次之。蛋白序列分析表明芒果中的CCD1基因编码的蛋白存在一个结构域RPE65,并且属于RPE65 superfamily家族。通过构建系统发生树,结果发现芒果CCD1基因所编码的蛋白序列与蜜柑、甜橙、栗子、大豆等的蛋白序列亲缘关系较近,可聚为一类,而与咖啡豆、菠菜、马铃薯、烟草的亲缘关系较远。芒果的CCD1与柑橘的CCD1的一致性为90%,有比较近的进化关系。亚细胞定位分析结果显示,芒果CCD1定位在细胞质中。对芒果的CCD1蛋白进行疏水性/亲水性预测,结果发现氨基酸疏水/亲水性主要介于+2.267^-0.633之间,CCD1蛋白属于亲水性蛋白。分析二级结构和三级结构得出CCD1基因编码的蛋白质主要由α-螺旋和无规则卷曲构成了其二级结构,α-螺旋占22.16%,无规则卷曲占37.43%。

摘要：以黄灯笼辣椒‘热辣2号’及抗、感病(黄瓜花叶病毒, CMV)黄灯笼辣椒自交系为实验材料,根据已发表的辣椒基因组数据设计引物,利用RT-PCR技术从‘热辣2号’中获得了一个茉莉酸氨基合酶基因(CcJAR1)。该基因开放读码框为1 728 bp,推断其编码575个氨基酸,分子量约为64.28 kD,根据序列比对结果将其蛋白命名为CcJAR1,对其进行信息学分析表明:CcJAR1与辣椒、番茄、茄子等茄科植物的JAR1相似性较高,而与核桃、猕猴桃等其他植物的相似性较低。荧光定量PCR分析表明,该基因在‘热辣2号’黄灯笼辣椒的根中表达量最高,在叶中次之,茎中的含量最低。该基因在抗病与感病种质叶片中均响应CMV侵染的胁迫,在感染初期上调,后期下调,抗病种质中的表达量低于感病种质。CcJAR1基因是茉莉酸氨基合酶基因,在植物响应胁迫的过程中发挥着重要作用,该基因的克隆与分析将为研究黄灯笼辣椒抗病分子机制提供理论依据。

摘要：为深入研究巴西橡胶树HbWRKY55调控天然橡胶生物合成机制,本研究根据已克隆的巴西橡胶树HbWRKY55的序列和橡胶树基因组序列信息设计引物,通过PCR技术获得了HbWRKY55起始密码子ATG上游1 587 bp的序列,利用Plant CARE数据库对该序列的调控元件进行分析。分析结果表明该启动子序列除具有多个典型的真核生物启动子基本元件如增强子元件CAAT-box、启动子核心序列TATA-box等外,还存在赤霉素反应元件GARE-motif、P-box以及水杨酸响应元件TCA-element等参与激素调控的应答元件,同时光应答元件BoxⅠ、Gap-box、Ⅰ-box、L-box、GAG-motif和GT1-motif,胚乳表达的调控元件GCN4-motif、Skn-1_motif和厌氧诱导元件ARE等顺式作用元件也包含其中。构建了该序列的4个5'端缺失片段和荧光素酶基因融合的表达载体,瞬时表达结果表明赤霉素(GA)、水杨酸(SA)可以抑制HbWRKY55启动子的活性,脱落酸(ABA)、茉莉酸甲脂(MeJA)可以加强HbWRKY55启动子的活性。在HbWRKY55启动子的-641^-455和-237^+1可能存在抑制ABA的元件;HbWRKY55启动子的-454^-238和-66^+1存在JA应答增强元件。本研究为深入了解HbWRKY55的调控机理提供帮助。