摘要：目的观察腺病毒介导的人EGF（Ad-hEGF）基因转染人表皮细胞的合适条件及转染对该细胞生物学特性的影响。方法取包皮环切术后弃用的新鲜人体包皮组织，通过酶消化法分离人表皮细胞，传代培养，采用第3代细胞进行以下实验。（1）按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为未转染组及5、20、50、100、150、200倍转染组，每组3孔。未转染组不转染Ad-hEGF基因，后6组分别按感染复数（MOI）5、20、50、100、150、200转染Ad-hEGF基因。转染24、48、72h，倒置相差显做镜下观察细胞形态，倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达。（2）另取3个批次细胞，分别同前分组处理，分别于转染24、48、72h，流式细胞仪检测Ad-hEGF基因转染率（样本数为3），ELISA法检测收集的细胞培养上清液中EGF质量浓度（样本数为6），细胞计数试剂盒8（CCK8）及酶标仪检测细胞增殖活性（样本数为6）。（3）另取细胞分为未转染组和转染组，每组6孔。未转染组用未转染细胞的细胞培养上清液孵育，转染组用以最佳MOI（50）转染Ad-hEGF基因细胞的细胞培养上清液孵育，分别于孵育1、3、5d，CCK8及酶标仪检测细胞分泌的EGF生物活性。（4）另取细胞分为未转染组和转染组，每组12孔。未转染组不转染Ad-hEGF基因，转染组以最佳MOI（50）转染Ad-hEGF基因。转染24h，免疫荧光染色法检测细胞角蛋白14（CK14）、CK19表达。（5）另取细胞，同（4）分组（每组6孔）处理，于划痕后0（即刻）、12、24、48h，倒置相差显微镜下观测细胞迁移距离。对数据行析因设计方差分析、重复测量方差分析、LSD检验。结果（1）转染24、48h，各转染组细胞形态与未转染组比较，无明显改变；转染72h，200倍转染组的细胞碎片较未转染组明显增多。转染24、48、72h，未转染组细胞未见绿色荧光蛋白表达，各转染组绿色荧光蛋白阳性细胞数随转染时间延长逐渐增多。（2）各转染组细胞***基因转染率随转染时间延长逐渐增高。转染72h，50～200倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率均大于90％；未转染组及5、20倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率则分别为（0．51±0．20）％、（62．44±6．23）％、（75．00±5．43）％，明显低于50倍转染组的（93．12±2．55）％，P值均小于0．01。随着转染时间的延长，各转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度逐渐增高；转染72h，50倍转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度明显高于其余各组（P值均小于0．01）。转染24、48h，各组细胞增殖活性相近（P值均大于0．05）；转染72h，200倍转染组细胞增殖活性明显低于其余各组（P值均小于0．05）。（3）孵育1d，2组细胞分泌的EGF生物活性相近（P〉0．05）；孵育3、5d，转染组细胞分泌的EGF生物活性明显高于未转染组（P值均小于0．01）。（4）转染24h，转染组细胞CK14、CK19表达较未转染组增强。（5）划痕后0h，2组细胞划痕宽度基本一致。划痕后12～48h，转染组细胞迁移距离明显长于未转染组（P值均小于0．01）。结论Ad-hEGF基因转染人表皮细胞的合适MOI为50～150，以50为最佳，以此MOI转染既能高效表达目的基因，又可保持细胞良好的增殖、分化和迁移能力。

摘要：目的探讨人羊膜间充质干细胞（hAMSC）培养上清液（hAMSC－CS）对人Fb生物学功能的影响。方法（1）取废弃胎盘新鲜羊膜组织，分离hAMSC，并进行传代培养。倒置相差显微镜下观察培养3 d及第3代hAMSC形态。（2）取2批次第3代hAMSC，免疫荧光染色法检测细胞波形蛋白表达，流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD73、CD105及CD45表达。（3）收集培养72 h的第3代hAMSC－CS，ELISA法检测其中胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF－Ⅰ）、血管内皮生长因子（VEGF）、EGF、bFGF的含量。（4）取包皮环切术后废弃包皮，分离人Fb，并进行传代培养。采用第3代人Fb进行以下实验。按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为空白对照组及10%、30%、50%、70%hAMSC－CS组，每组48孔。空白对照组用含体积分数2%FBS的DMEM/F12培养液培养，后4组分别用含相应体积分数hAMSC－CS和体积分数2%FBS的DMEM/F12培养液培养。培养12、24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8及酶标仪检测细胞增殖活性。选取使人Fb增殖活性最高的相应体积分数hAMSC－CS用于以下实验。（5）另取人Fb，分为空白对照组及50%hAMSC－CS组，同（4）处理，每组4孔。分别于划痕后0（即刻）、12、24、48、72 h，于倒置相差显微镜下观测细胞迁移距离。（6）另取人Fb，同（5）分组处理，每组3瓶，流式细胞仪检测细胞凋亡率。对数据行析因设计方差分析、重复测量方差分析、单因素方差分析、LSD检验、t检验。结果（1）培养3 d，多数hAMSC形态较大，呈纺锤形多突起的Fb样或扁平多角形。第3代hAMSC呈梭形或纺锤形，波形蛋白表达呈强阳性，细胞表面标志物CD90、CD73、CD105表达阳性，CD45表达阴性。（2）hAMSC－CS中IGF－Ⅰ、VEGF、EGF、bFGF的含量分别为（11.7±1.0）、（316±68）、（6.1±0.4）、（1.49±0.05）pg/mL。（3）培养12～72 h，各hAMSC－CS组人Fb增殖活性明显高于空白对照组（P值均小于0.01），50%hAMSC－CS组人Fb增殖活性最高。（4）划痕后0 h，2组人Fb划痕宽度几乎相同。划痕后12～72 h，50%hAMSC－CS组人Fb迁移距离明显长于空白对照组（P值均小于0.01）。（5）空白对照组人Fb凋亡率为（16.2±2.4）%，明显高于50%hAMSC－CS组的（7.4±3.6）%（t＝6.710，P〈0.01）。结论hAMSC－CS对人Fb的增殖和迁移具有促进作用，对人Fb的凋亡有抑制作用。