摘要：为了建立一套用于实验室及室外现场检测迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda,Et)的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以迟钝爱德华菌的毒力基因fimA为靶基因设计特异性引物,以基因组DNA为模板,进行环介导恒温扩增,并对其特异性、灵敏性和临床检测进行了试验。结果显示,迟钝爱德华菌阳性样本反应呈现为荧光绿色,阴性样本不变色。该LAMP方法的最适反应温度为63℃;特异性试验表明仅迟钝爱德华菌样本发生反应,而杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温气单胞菌和豚鼠气单胞菌均不发生反应;敏感性试验表明,该LAMP方法可检出浓度为2.16×10^(-5)mg/L的迟钝爱德华菌的核酸。

摘要：为改善鲟鱼骨胶原的营养价值和生理功能,提高骨胶原多肽得率,提升水产品的附加值,采用碱性蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解技术,以肽得率为指标,通过单因素试验、正交设计试验优化骨胶原多肽的酶解条件。采用CCK-8法测定鲟鱼骨胶原多肽对人源结直肠癌细胞Caco-2、乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HeGp2、肺癌细胞A549及宫颈癌细胞HeLa 5株癌细胞增殖的抑制能力,并选取抑制效果明显的肺癌细胞A549为模型,进一步检测鲟鱼骨胶原多肽作用后对其caspase-1、caspase-3以及细胞膜电位的影响。结果表明:1)鲟鱼软骨胶原肽的酶解工艺条件为:加酶量1.5×10~5 IU/g,骨粉与水质量比1∶25,酶解时间5 h,酶解温度50℃,碱性蛋白酶与中性蛋白酶酶活力比1∶2。该条件下骨胶原蛋白肽得率为(72.36±2.33)%;2)抑癌活性测定结果显示,鲟鱼骨胶原多肽通过激活凋亡蛋白酶caspase-1,使细胞线粒体膜电位发生改变,膜电位降低,诱导caspase-3酶活力增加,酶活力可达149.9 IU/μg,进而促进细胞凋亡的发生,抑制细胞的增殖。鲟鱼骨胶原多肽具有抑制癌细胞增殖的能力,有潜在的开发应用前景。

摘要：旨在构建西伯利亚鲟(Acipenser baerii)MHCⅡβ基因原核表达载体高效表达,并进行多克隆抗体的制备。根据GenBank西伯利亚鲟MHCⅡβ基因序列设计引物,并加上6-His标签和酶切位点,从西伯利亚鲟脾脏细胞中克隆可读编码框(不含信号肽)部分,克隆并测序鉴定后构建Pet30α-MHCⅡβ质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导表达,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western Blot)鉴定,诱导表达的融合蛋白大小约为32 ku,能够与His抗体结合,融合蛋白主要以包涵体形式存在,在温度37℃时1 mmol/L的IPTG诱导4 h可以达到最佳表达量。将表达蛋白通过镍柱层析纯化后,制备兔多克隆抗体,抗体效价达到243 W,为深入研究西伯利亚鲟MHCⅡβ基因免疫学功能提供参考。

摘要：以小体鲟(Acipenser ruthenus)为研究对象,应用不同浓度的淋巴细胞分离液对鲟鱼外周血淋巴细胞进行分离并探讨其增殖性反应的最佳条件。分别以植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(Con A)和脂多糖(LPS)作为淋巴细胞增殖丝裂原,采用L25(56)五因素五水平正交试验设计,用Enhanced Cell Counting Kit-8法(增强型CCK-8或WST-8)对培养时间、培养温度、细胞密度、胎牛血清浓度及丝裂原浓度等因素进行探索性研究。结果表明:70%的Percoll液(比重为1.092 g/m L)作为淋巴细胞分离液的分离效果最佳。鲟鱼最佳外周血淋巴细胞体外增殖反应条件为:3.625×10~6初始细胞量、20μg/m L的PHA或50μg/m L的Con A或10μg/m L的LPS作为丝裂原、10%-20%胎牛血清(FBS)、20-25℃培养2 d。

摘要：为了给传染性造血器官坏死病(Infectious Hematopoietic Necrosisvirus,IHN)的防控提供特异、灵敏、快速的检测方法,根据NCBI基因库中传染性造血器官坏死病病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus,IHNV)保守序列设计特异性引物和探针,建立IHNV的逆转录重组酶介导扩增(Reverse Transcription Recombinase-aid Amplification,RT-RAA)检测技术。结果表明,该方法具有很高的特异性。其最低可检出100 copies/μL,检测灵敏度与OIE建议的RT-PCR方法相当。对35份虹鳟(含金鳟)养殖场样品检测并与RT-PCR方法进行比较,该方法的检测结果符合率达到96%以上。本文建立的RT-RAA方法具有操作简便、灵敏度高、特异性好、检测周期短、不需要昂贵仪器,结合荧光探针能够实现实时检测以及现场快速检测等优点。该方法的建立及应用可为IHN防控提供新的有用的检测工具。

摘要：实验建立了一套反转录环介导等温扩增方法( reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),用于实验室及现场检测鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病毒( infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)。针对IHNV的核蛋白基因设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶及Bst DNA聚合酶的作用下进行反转录LAMP,结果阳性样本表现为荧光绿色,阴性样本仍为红棕色。反应条件优化结果表明最适反应温度为64 ℃;特异性试验表明仅IHNV发生特异性扩增,而SVCV、HRV、VHSV和H 2 O均不发生反应;敏感性试验表明该LAMP方法可检出浓度为1.0×10^-4 μg/μL的IHNV核酸。本研究所建立的IHNV反转录LAMP检测法成本低、操作简单、反应迅速、不依赖专门的仪器,同时具有较高的灵敏度和特异性,适合IHNV的现场检测和大批量样品的检疫。

摘要：斑马鱼(Danio rerio)在糖负荷状态下表现出持续高血糖现象。与对照组(仅腹腔注射灭菌去离子水)相比,葡萄糖组(仅腹腔注射葡萄糖)血浆胰岛素水平无显著差异,胰岛素基因表达显著上调,肝胰脏葡萄糖转运蛋白(glucose transporters,GLUTs)基因表达无显著差异,说明斑马鱼自身胰岛素分泌不足和葡萄糖转运迟缓是导致其在糖负荷状态下持续高血糖的原因。为了观察外源性胰岛素对斑马鱼血糖及其在体内转运的影响,设计低(1.25 IU/kg)、中(12.5 IU/kg)、高(125 IU/kg)3个浓度的胰岛素,分别与葡萄糖溶液(0.1 g/m L)共注射斑马鱼并观察其血糖变化。结果表明,低剂量胰岛素能有效促进斑马鱼血糖的降低,且能直观反映糖负荷后血糖的变化情况,为最适注射浓度。此外,研究显示斑马鱼血糖变化不受性别影响。在胰岛素最适注射浓度下,与葡萄糖组相比,胰岛素组(葡萄糖与胰岛素共注射)可以显著减少斑马鱼血糖恢复到正常水平的时间,进一步分析发现,斑马鱼血浆胰岛素水平增加,肝胰脏葡萄糖转运蛋白基因表达显著上调,但胰岛素基因表达却被显著抑制。综上所述,胰岛素分泌不足和葡萄糖转运迟缓是造成斑马鱼持续高血糖的原因;外源性胰岛素能够促进糖负荷状态下斑马鱼血糖的降低,但是具有反馈抑制斑马鱼肝胰脏胰岛素基因表达的作用。