摘要：目的 采用SYBR GreenⅠ染料建立实时定量PCR法检测CHO细胞外源抗体轻链(light chain,LC)、重链(heavy chain,HC)基因拷贝数,并进行方法的验证及初步应用。方法 以CHO细胞中稳定表达的B2m(β2-microglobulin)基因作为内参基因,分别设计适宜的LC和HC基因引物及内参基因引物,确定实时定量PCR方法的反应体系和反应程序。对建立的方法进行特异性、线性、精密性及耐用性验证,并采用建立的方法检测重组细胞株工作细胞库(WCB)及不同传代次数细胞中LC和HC基因拷贝数。结果 外源基因与内参基因引物可特异性结合目标片段;B2m、LC、HC基因引物扩增效率分别为106.7%、106.3%和99.1%,线性方程相关系数均大于0.99,具有良好的线性关系;精密性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于1%;短时间内少次冻融对检测结果影响较小。利用建立的方法检测不同代次重组细胞株LC和HC基因拷贝数,未见明显变化。结论 成功建立了CHO细胞外源基因拷贝数实时定量PCR检测方法,该方法特异性、线性、精密性及耐用性良好,为其他CHO细胞株表达的外源基因拷贝数检测提供了参考。

摘要：副本交换分子动力学(REMD)是一种广泛应用于蛋白质功能性构象变化模拟及相应自由能计算的增强型采样算法。由于REMD理论严格且采样效率高,近年来备受关注,尤其是针对传统REMD方法的发展和优化,显著提高了REMD的采样效率,拓展了其应用范围。但是各种REMD新型方法的最佳适用范围也存在较大区别,使得如何选用合适的REMD方法成为实际应用的难题和挑战。因此,有必要对各种REMD方法及其应用进行阐述,深入比较各方法的优缺点及其实际应用体系。本综述从REMD的原理出发,回顾了近年来各类REMD方法的变形策略,以助于对REMD方法的理解、应用和继续改进。

摘要：目的拟建立检测溶瘤病毒药物HSV-1/hPD-1在小鼠和食蟹猴各组织器官中生物分布的实时定量核酸扩增检测(q PCR)试验方法,并利用该方法对食蟹猴重复给药毒性研究中伴随生物分布(含排泄)研究收集的样本进行检测。方法针对药物的特异性基因序列,设计合成引物对和探针,摸索适宜的PCR反应条件,构建检测用标准曲线并进行方法学验证。对食蟹猴重复给药HSV-1/hPD-1长毒试验中收集的组织脏器,包括血液、性腺(睾丸/附睾或子宫/卵巢)、肾、肝脏、肺、心脏、脑、脾脏、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、注射部位、泪腺、唾液腺、背根神经节、尿、粪进行qPCR检测,测定药物在各组织器官中拷贝数。结果成功建立标准曲线pMD18T-1093,可用于定量检测药物在小鼠或食蟹猴基因组中分布拷贝数,是通用型标准曲线。食蟹猴组织检测结果显示,药物主要分布在给药部位,少量分布至肺、脑,经过尿液排泄至体外,在其他组织脏器无分布。靶器官分布数量呈剂量依赖性增加,会伴随时间延长减少至消除,不会在体内蓄积。脑组织检出药物分布不排除与样本污染有关。结论本研究成功建立了在非临床阶段开展生物分布研究的检测技术方法。试验方法的建立过程和研究思路对于其他基因治疗药物开展生物分布研究具有一定的借鉴意义。

摘要：中药滋味特征是中药开发及生产过程控制的质量属性。研究针对中药大品种小儿感冒口服液用药依从性亟待改进的问题,建立了电子舌传感器信号值与人真实感官评价得分值的关联模型,并采用统计试验设计关键技术,设计了小儿感冒口服液口感改进方案。基于上述关联模型优选得到最优口感配方:阿斯巴甜添加量为1~2 mg·mL^(-1);安赛蜜添加量为1.5~3 mg·mL^(-1);甜菊糖苷添加量为1~2 mg·mL^(-1)。进一步,通过人真实感官评价方法对最优口感配方进行验证,成功实现了小儿感冒口服液口感改进。该文以小儿感冒口服液为例,建立了基于电子舌与人真实感官关联的口感配方优化方法,为其他中药口服液体制剂口感改进提供重要参考。

摘要：目的评价克洛己新分散片和克洛己新片在中国健康成年人体内的药代动力学与相对生物利用度。方法用单中心、随机、开放、两周期、交叉的试验研究设计。24例健康受试者随机交叉单次口服受试制剂和参比制剂516 mg,用HPLC-UV法测定头孢克洛的血药浓度,用LC-MS/MS法测定溴己新的血药浓度,用WinNonlin 6.1软件计算药代动力学参数。结果受试者服用受试制剂和参比制剂后,血浆中头孢克洛受试制剂和参比制剂的C_(max)分别为(13.00±3.72)和(11.15±3.62)μg·mL^(-1),t_(max)分别为(0.87±0.53)和(1.08±0.80)h,AUC_(0-t)分别为(17.05±2.76)和(16.85±2.87)μg·mL^(-1)·h,AUC_(0-∞)分别为(17.32±2.78)和(17.02±2.86)μg·mL^(-1)·h;AUC_(0-t)和AUC_(0-∞)的90%置信区间(CI)分别为96.56%~106.23%和97.26%~106.89%。血浆中溴己新受试制剂和参比制剂的C_(max)分别为(16.29±7.44)和(13.23±7.96)ng·mL^(-1),t_(max)分别为(0.92±0.57)和(1.37±0.95)h,AUC_(0-t)分别为(34.46±12.99)和(31.36±12.04)ng·mL^(-1)·h,AUC_(0-∞)分别为(37.26±13.56)和(33.92±12.36)ng·mL^(-1)·h;AUC_(0-t)和AUC_(0-∞)的90%CI分别为98.46%~124.16%和98.72%~123.09%。结论受试制剂和参比制剂中头孢克洛及溴己新的AUC等效。

摘要：Ras/Raf/MEK/ERK信号通路,在肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、转移、代谢等过程中起着重要的作用,本文着眼于Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中的关键靶点,以法尼基转移酶(FTase)为主靶点,以Raf-1激酶为次靶点,借助计算机辅助药物设计(CADD),构建法尼基转移酶抑制剂(FTIs)和Raf-1激酶抑制剂的药效团模型,设计出同时与这两个靶点相匹配的多靶点配体药物。所设计的多靶点配体药物以氨甲基苯甲酸为母核结构,具有较好的预测活性。

摘要：该研究以SD雄性大鼠为研究载体,连续灌胃维甲酸2周建立继发性骨质疏松大鼠模型,基于骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)/Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)/Osterix信号通路探讨淫羊藿黄酮低糖苷组分(low glycoside from Epimedii Folium flavonoids,LG)对继发性骨质疏松大鼠的治疗作用及机制。以仙灵骨葆胶囊(XLGB)为阳性对照药物,淫羊藿黄酮低糖苷组分设计低(LG-L)、中(LG-M)和高(LG-H)3个剂量组,造模结束后,各实验组灌胃对应药物8周。通过大鼠体质量、心脏指数和睾丸指数等脏器指数指标,分析LG治疗继发性骨质疏松大鼠的作用部位。通过股骨病理变化、骨小梁微观结构参数和股骨骨生物力学性质,表征其疗效。通过测定继发性骨质疏松大鼠血清生化指标,BMP-2、Runx2和Osterix蛋白含量的变化探究其作用机制。结果发现,LG治疗继发性骨质疏松大鼠的作用部位是睾丸,LG可以通过改善股骨的骨丢失程度,增加骨小梁数量和厚度,降低骨小梁孔隙度和分离度,同时提高骨的抗变形和抗破坏能力,上调骨质疏松大鼠血清中Ca、P、Ⅰ型前胶原氨基端肽(typeⅠprocollagen amino-terminal peptide,PINP)和骨钙素(osteocalcin,OC)的含量,促进骨基质钙化,促进BMP-2、Runx2和Osterix蛋白的表达,加快骨形成,从而降低骨折发生的危险性,最终发挥抗继发性骨质疏松疗效。

摘要：目的采用离心萃取系统萃取毛蕊花糖苷提取物。方法通过单因素试验,研究油相中毛蕊花糖苷含量、流量、油水相比、萃取次数、转速、pH对毛蕊花糖苷萃取率的影响。利用响应面Box-Behnken实验设计探究油相中毛蕊花糖苷含量、流量、转速、油水相比对毛蕊花糖苷萃取率的影响并优化最优工艺参数。结果单因素试验结果表明:萃取最佳条件为油相中毛蕊花糖苷含量为19.20 mg·mL^(-1),转速为48 Hz,流量为300 mL·min^(-1),油相与水相比=1∶1,乙酸加入量为2%,萃取次数为3次。通过响应面分析发现各因素对毛蕊花糖苷萃取率的影响顺序为油相中毛蕊花糖苷含量>油水相比>流量>转速;在最佳条件下:油相中毛蕊花糖苷含量21.50 mg·mL^(-1)、转速48 Hz、流量290 mL·min^(-1)、油水相比1∶1,3次平行试验得到的毛蕊花糖苷萃取率分别达82.49%,79.38%,81.76%,与预测值80.03%的相对误差分别为3.07%,0.81%,2.16%。结论此方法能够有效对毛蕊花糖苷进行纯化,为毛蕊花糖苷的开发利用提供理论依据。

摘要：目的研究中国健康受试者细胞色素P4502C9(CYP2C9)及细胞色素P4502C19(CYP2C19)基因多态性对塞来昔布在体内药代动力学(PK)的影响。方法采用单剂量、两制剂、两周期、双序列、随机交叉试验设计。空腹和餐后试验均入组31例受试者,空腹或餐后条件下单次口服塞来昔布胶囊0.2 g,用液相色谱串联质谱方法测定塞来昔布血样浓度,计算主要PK参数。用一代测序(Sanger测序)法对CYP2C9、CYP2C19基因多态性位点进行检测分型,并分析塞来昔布在各基因型受试者体内代谢特征的差异。结果空腹组CYP2C9*3 AA和AC基因型的AUC0-t分别为(5346.36±1806.39)和(10112.46±2835.19)ng·mL^(-1),Cmax分别为(489.37±220.53)和(1034.86±264.60)ng·mL^(-1),tmax分别为(2.80±1.55)和(2.83±0.29)h。携带CYP2C9*3 AC基因型受试者与AA基因型比较,Cmax和AUC0-t差异均有统计学意义(均P0.05)。餐后组CYP2C9*3 AA和AC基因型的AUC0-t分别为(7496.90±2625.10)和(9941.29±2073.53 ng·mL^(-1),Cmax分别为(1289.61±410.86)和(1501.06±55.05)ng·mL^(-1),tmax分别为(4.12±1.19)和(4.50±5.95)h;CYP2C9*2 CC和CT基因型的AUC0-t分别为(7666.83±2680.01)和7287.80 ng·mL^(-1),Cmax分别为(1304.11±407.37)和1277.47 ng·mL^(-1),tmax分别为(4.17±1.17)和3.5 h。携带CYP2C9*3 AC基因型受试者与AA基因型比较,携带CYP2C9*2 CT基因型受试者与CC基因型比较,主要PK参数均无统计学意义(均P>0.05)。结论CYP2C9基因多态性可能影响塞来昔布体内PK过程。在临床应用时,应充分考虑CYP2C9基因多态性的影响,保障临床用药的安全性和有效性。

摘要：随着稳定同位素示踪代谢组学技术的广泛应用,对数据的全面分析和深入挖掘显得尤为重要,代谢流分析是主要的技术手段之一,特别是在葡萄糖代谢研究中受到高度关注。代谢流分析技术将同位素示踪与数学模型结合,推导计算出代谢物间的代谢通量,为研究提供了更多的信息,更清晰、具体地反映了一个动态的代谢过程。本文对代谢流分析在葡萄糖代谢研究中的基本流程、注意事项、应用实例等进行综述,为基于稳定同位素示踪代谢组学的代谢流分析技术研究葡萄糖代谢提供科学依据。