摘要：乙酰胆碱酯酶是用酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的关键用酶,本研究利用毕赤酵母表达系统分泌表达人乙酰胆碱酯酶,并评估其对8种农药的敏感性,为工业化大规模生产高敏感性酶源奠定基础。根据GenBank上已发表的人乙酰胆碱酯酶(human acetylcholinesterase,hAChE)基因核酸序列设计引物,从pReceiver-M02-hAChE-ORF质粒中扩增出hAChE的开放阅读框(open reading frame,ORF)片段,接着利用SnaBⅠ和AvrⅡ双酶切将其克隆至载体pPIC9K中,构建pPIC9K-hAChE表达载体,然后将SalⅠ线性化的pPIC9K-hAChE电转化至毕赤酵母GS115中,在含4.00mg/mLG418抗性平板上筛选获得阳性克隆,最后经0.5%甲醇诱导分泌表达144h,发现其发酵上清液的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱在65kDa处有一条明显的蛋白条带,大小与预期的hAChE蛋白一致。利用Q-Sepharose FF柱层析法对其总蛋白进行纯化,获得了较纯的人乙酰胆碱酯酶。用Bradford法测得发酵上清液中hAChE蛋白质量浓度为1.330mg/mL,占总蛋白的5.58%,纯化后比酶活达到1080nmol(/ min mL)。通过初步计算比对重组工程菌发酵上清液对8种常见农药的半抑制浓度,得出敌百虫>敌敌畏>克百威>马拉硫磷>乐果>甲胺磷>甲萘威>毒死蜱,即人乙酰胆碱酯酶对毒死蜱最敏感。

摘要：通过提取膜荚黄芪叶片总RNA进行反转录合成cDNA,根据GenBank上已发表的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)核酸序列设计引物,从cDNA中扩增到PAL的开放阅读框区段,并将该区段亚克隆到pUCm-T载体上.通过设计与毕赤酵母表达载体pPIC9K具有同源区段的引物,从pUCm-T-PAL上扩增出带同源臂的PAL,利用体外同源重组技术将其克隆到pPIC9K中构建成pPIC9K-PAL表达载体.与传统的酶切连接载体构建方法相比,该方法可避免酶切位点可利用性的限制.将SalⅠ线性化的pPIC9K-PAL电转化至毕赤酵母GS115中,于2.0mg/mL G418抗性平板上进行筛选获得阳性克隆.经1%甲醇诱导120h后,重组菌株GS115/pPIC9K-PAL与负对照相比,其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳图谱在77.96ku处有1条明显的蛋白带,大小与预期PAL蛋白一致.利用Q-Sepharose FF蛋白纯化柱对总蛋白进行纯化,获得了较纯的苯丙氨酸解氨酶.Bradford法测得纯化后PAL质量浓度为0.08mg/mL,含量占总蛋白的11.54%,最高比活达到4 270U/mg.