摘要：目的建立一种能同时、快速、准确地检测包括:麻疹病毒、风疹病毒、肠道病毒71型、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组β型酿脓链球菌(溶血性链球菌)、伤寒沙门菌,9种发热伴出疹病原体的化学发光基因芯片的方法。方法根据9种病原体特异基因中的高度保守区序列设计引物与探针,进行多重不对称PCR扩增,将带有标记的扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交,经洗涤、化学发光显色后进行结果分析。经多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件的优化,评价该芯片的特异性、灵敏度和重复性。实时荧光PCR法与芯片法分别检测肠道病毒EV71梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。结果共筛选出9对特异性扩增引物和11条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性、灵敏度和重复性。质粒参考品和体外转录RNA参考品的最低检测限为3×10~3拷贝/反应,芯片法的灵敏度为实时荧光PCR法的1/10。检测74例临床样本的灵敏度为95%,特异性为85.7%,总符合率为93.2%。结论建立了一种可同时检测9种发热伴出疹病原体的化学发光基因芯片的检测方法,为发热伴出疹的临床诊断和流行病学调查提供了一种高通量的筛查手段。

摘要：目的利用多重实时荧光PCR技术,建立快速鉴定布鲁氏菌的方法。方法根据布鲁氏菌特异性基因BCSP31,AlkB/IS711和BMEI1162/IS711的部分片段作为靶基因,分别设计探针引物,将扩增产物连接到PUCm18-T载体上,制备标准品及标准曲线,确定此方法的灵敏度。利用布鲁氏菌的其他生物型菌株和同源性较近的致病菌(汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O157∶H7、大肠杆菌O∶16、小肠结肠炎耶尔森菌O∶9、沙门氏菌N群血清型、嗜麦芽假单胞菌)验证所建立方法的特异性。通过布鲁氏菌标准菌株建立方法,优化体系后扩增97株地方株进行验证。结果应用多重Taq-Man荧光PCR技术检测布鲁氏菌结果显示,布鲁氏菌属、牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌有各自的荧光信号,而与其同源性较高的致病菌均未见荧光信号;由标准曲线可知该方法的单重和多重荧光PCR最低检测下限均约为102copy/μL(13～24fg/μL),是常规PCR灵敏度的100倍。结论建立的方法有灵敏度高、快速易操作等优点,可用于布鲁氏菌快速鉴定,并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。