摘要：目的:克隆杜氏盐藻鞭毛相关蛋白(FAP)的cDNA片段并探讨其功能。方法:分析莱茵衣藻等生物的FAP同源蛋白的氨基酸序列保守区域,设计简并引物。提取盐藻总RNA进行RT-PCR。根据得到的序列设计3’RACE引物,巢式PCR扩增该cDNA的3’端序列。秋水仙碱处理对数生长期的盐藻细胞,使细胞停留在分裂中期,并诱导鞭毛缩短,半定量PCR检测FAP基因的表达情况。结果:RT-PCR和3’RACE分别得到长1535bp和782bp的cDNA片段,拼接后总长2141bp,编码541个氨基酸。序列比对发现与莱茵衣藻的FAP(88%)、团藻CDC48(89%)氨基酸序列均有较高的同源性。秋水仙碱处理后盐藻细胞FAPmRNA表达量高于未处理对照组(F组间=43.192,P<0.001;F时间=2.659,P=0.043;F交互=594.419,P<0.001)。结论:成功获得杜氏盐藻FAP的cDNA片段,该基因在秋水仙碱诱导的鞭毛重吸收过程中表达量增高。

摘要：目的:获得FLA8基因cDNA序列。方法:根据衣藻、小球藻等驱动蛋白-2亚基的氨基酸高度保守序列GYNGTIF、NEDPKDA设计一对简并引物,采用RT-PCR及3’RACE和5’RACE的方法扩增杜氏盐藻FLA8基因的全长。结果:克隆得到的杜氏盐藻FLA8基因cDNA全长序列为2612bp,序列分析显示其包括90bp的5’UTR、167bp的3’UTR以及2355bp的开放阅读框,其编码784个氨基酸残基,蛋白质的理论等电点为6.65,相对分子质量为85097。氨基酸序列同源性分析显示其与其他物种有较高的同源性:团藻(98%)、衣藻(99%)、小球藻(92%)。结论:得到杜氏盐藻驱动蛋白-2亚基FLA8的基因全长。

摘要：目的:用酵母双杂交的方法筛选与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基(FLA8)C端相互作用的蛋白。方法:设计特异性引物(上下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点),扩增FLA8C端(433个氨基酸)cDNA,与穿梭载体pGBKT7连接以构建诱饵表达载体,然后转化酵母菌株Y187和AH109,Westernblot法检测诱饵蛋白在转化酵母菌株内的表达。通过自激活实验和毒性实验检测诱饵表达载体是否适合利用酵母双杂交的方法筛选相互作用蛋白。转化诱饵质粒的酵母菌株Y187与AH109(文库菌)杂交,待三叶形合子形成后用营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶活性实验筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行测序。结果:成功构建了pGBKT7-FLA8-C双杂交诱饵载体;经检测该载体的表达产物对Y187和AH109均无自激活和毒性作用,可用于酵母双杂交实验;杂交后筛选得到2个阳性克隆,测序结果显示为鞭毛结合蛋白107(FAP107)和含蛋白结合结构域的预测蛋白。结论:成功筛选得到了与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基C端相互作用的蛋白,分别为FAP107和预测蛋白。