摘要：为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响,本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1000 bp的同源臂,分别克隆至pBS-EGFP及pBS-Mcherry载体中,构建同源臂质粒pBS-GFP-H240R和pBS-Mcherry-MGF505-7R,采用PCR和测序鉴定正确。根据CRISPR/Cas9系统sgRNA设计原则设计分别靶向H240R和MGF505-7R基因的小向导RNA(sgRNA),并克隆至pX330载体中,构建重组质粒pX330-sgH240R和pX330-sgMGF505-7R,经测序鉴定正确后,将线性化的同源臂质粒pBS-GFP-H240R与pX330-sgH240R共转染猪肺泡巨噬细胞(PAM),再以ASFV感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建H240R基因缺失病毒ASFV-ΔH240R;采用上述类似的方式构建MGF505-7R基因缺失病毒ASFV-Δ7R;在ASFV-ΔH240R的基础上,将线性化的同源臂质粒pBS-Mcherry-MGF505-7R与pX330-sgMGF505-7R共转染PAM后,再以ASFV-ΔH240R感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建双基因缺失病毒ASFV-ΔH240R-Δ7R。上述3株基因缺失病毒均采用PCR和测序鉴定正确后,均以MOI 1感染PAM,24 h后于荧光显微镜观察;同时采用红细胞吸附试验测定不同培养时间的病毒载量即半数红细胞吸附量(HAD50),并绘制各病毒的生长曲线。结果显示,ASFV-ΔH240R、ASFV-Δ7R及ASFV-ΔH240R-Δ7R感染的PAM分别出现绿色荧光、红色荧光及红绿色双色荧光,而ASFV-WT感染的细胞无荧光,表明正确构建各基因缺失病毒。生长曲线测定结果显示,ASFV-Δ7R和亲本病毒生长曲线基本一致,ASFV-ΔH240R复制水平显著低于亲本病毒(P<0.001),ASFV-ΔH240R-Δ7R复制水平显著高于ASFV-ΔH240R(P<0.01),但仍低于亲本株。表明MGF505-7R基因与病毒的复制无关,但H240R基因与病毒的复制有关,在ASFV-ΔH240R的基础上缺失MGF505-7R基因则可部分恢复病毒的复制能力。本研究构建了3株基因缺失ASFV并测定其生长曲线,为进一步研究ASFV基因功能提供了数据参考。