摘要：基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了H9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。

摘要：目的探讨胸中段食管癌术后局部复发的规律,为术后放射治疗的靶区设计提供依据。方法回顾性分析安阳市肿瘤医院2009年1月至2014年6月收治的561例胸中段食管癌术后局部复发患者的临床资料,采用χ^2检验分析各复发区域情况。结果术后局部复发时间为1-104个月,中位时间14个月。术后复发率最高的区域为纵隔77.7%（436/561）,其次为锁骨上29.2%（164/561）,吻合口7.7%（43/561）,腹腔3.9%（22/561）和原瘤床0.5%（3/561）,5个区域的复发率比较差异有统计学意义（P=0.000）。上纵隔淋巴结转移率达73.1%（410/561）,中纵隔为19.6%（110/561）,下纵隔为4.4%（25/561）,三者间比较差异有统计学意义（P=0.000）。纵隔转移淋巴结分区中1R区为33.9%（190/561）,2R区为20.5%（115/561）,4R区为7.6%（43/561）,1L区为12.8%（72/561）,2L区为10.3%（58/561）,4L区为10.2%（57/561）,3区（3A＋3P）为14.3%（80/561）,7区为23.0%（129/561）;以1R区较多,6区、8-10区较少,差异有统计学意义（P=0.000）;上纵隔淋巴结转移主要分布于气管旁,其中左气管旁区（1L、2L、4L）淋巴结转移率为30.3%（170/561）,右气管旁区（1R、2R、4R）淋巴结转移率为45.8%（257/561）,右气管旁淋巴结转移率高于左气管旁区（P=0.000）。结论胸中段食管癌术后复发位置主要在双侧锁骨上、中上纵隔、吻合口,建议术后预防放射治疗靶区采用以双侧锁骨上区、上纵隔1-5区、中纵隔7区及吻合口为主的T型野。

摘要：目的:分别构建人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒载体并建立其过表达(NB4-pCDH-p100)和降表达(NB4-pLKO-shp100)的NB4人白血病细胞系。方法:对于人类P100蛋白过表达慢病毒质粒构建,利用Eco RI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒pEGFP-C2-p100进行双酶切以获得p100基因片段,回收纯化后连接到慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上;对于人类P100蛋白降表达慢病毒质粒构建,设计针对人类p100基因的siRNA序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建pLKO.3G-shp100质粒。将构建好的P100蛋白过表达和降表达质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装产生假病毒颗粒。收集浓缩假病毒颗粒感染NB4细胞,并筛选单克隆细胞株。荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测细胞株中P100蛋白的表达水平。结果:通过对重组质粒进行酶切鉴定,观察到插入的人类p100片段和其干扰片段,并获得了P100蛋白过表达和降表达NB4细胞株,荧光显微镜下检测到感染效率达90%以上,Western blot方法证实NB4-pCDH-p100细胞株中P100蛋白表达水平明显增高,NB4-pLKO-shp100细胞株中P100蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建了人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒并建立其过表达和降表达白血病细胞株,可为有关人类P100蛋白功能及作用机制研究奠定基础。