摘要：为快速检测牛外周血淋巴细胞中的牛白血病病毒(bovine leukem ia vir,uBsLV)前病毒DNA,选取BLVenv基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立检测牛白血病前病毒DNA的荧光PCR方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价及实际样本的验证检测。结果显示,该方法具有很高的特异性和重复性,最低检出限为每个反应可检出3个拷贝数的阳性标准质粒对照。在175头BLV抗体阳性牛中,用该方法共检出127头BLV感染牛。在262头BLV抗体阴性牛中,用该方法检出2头BLV感染牛,该方法与套式PCR之间检测结果的符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的方法可用于BLV感染牛的确证。

摘要：为实现袋鼠临床样本中疱疹病毒1型(Macropodid herpesvirus 1,MaHV-1)的出入境快速检测,基于MaHV-1的gB基因序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种MaHV-1荧光PCR检测方法。试验结果显示,该方法只对MaHV-1 gB基因呈现特异性扩增,与禽传染性喉气管炎病毒、伪狂犬病毒和牛传染性鼻气管炎病毒不发生交叉反应,对阳性标准质粒对照(pCR-MaHV-1-gB)的最低检测限为8个拷贝数/反应。该方法的组内和组间试验的Ct值变异系数介于0.17%～0.96%之间,具有良好的重现性。试验结果表明,本研究建立的实时荧光PCR方法可用于袋鼠MaHV-1的病原学检测。

摘要：为建立一种快速检测赤狐皮毛的方法,试验根据赤狐皮毛线粒体COX3基因保守区设计了特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应条件建立了一种检测赤狐皮毛的Taq Man探针荧光PCR检测方法。结果表明,该方法对赤狐皮毛具有特异性,不与兔皮毛、山羊皮毛、绵羊皮毛、貂皮毛和貉子皮毛发生交叉反应。该方法对质粒标准对照(PUC-VV-)的最适线性检测范围为4.8×10^(1)~4.8×10^(8) copies/μL,标准曲线方程为Y=-3.4752X+40.118,相关系数(r^(2))为0.9897,检测下限为48 copies/μL。对3个不同浓度的pCR-GPTV-ITR进行组内试验和组间试验,每个浓度的重复试验Ct值的变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。采用该方法检测2份赤狐皮毛为阳性,其他10份动物皮毛样品为阴性。本方法的建立为赤狐皮毛检测提供了一种快速准确的技术手段。

摘要：为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光PCR方法并研制配套检测试剂,本研究以非洲猪瘟病毒E183L基因为靶基因,运用TaqMan探针法建立检测方法,并对其进行验证评价。根据E183L基因序列设计特异性引物和探针,将目的片段克隆到pBackZero-T载体,并转化至大肠杆菌JM109中制备标准品,并绘制标准曲线。同时对本方法的灵敏度、特异性、重复性和实际样品检测效果进行评价,并由WOAH非洲猪瘟参考实验室对该方法和试剂进行验证。结果显示,本研究以3.3×10^(7)~3.3×10^(1) copies/μL浓度范围内的质粒为标准品建立标准曲线;所建立的方法与其他几种常见猪病病毒无交叉反应;最低检测下限为3.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%;对WOAH参考实验室阳性样品的评估试验表明,本研究建立的方法与参考实验室推荐方法的符合率为93.8%。运用该方法检测国内猪场、无害化处理厂、屠宰厂和市售样品34350份,检出环境阳性81份,检出率略高于WOAH推荐方法。上述结果表明,本试验所建立的方法适用于血液、拭子、猪肉制品以及环境样品中ASFV检测和猪场监控检测,可作为ASFV的诊断及分子流行病学调查的技术手段。

摘要：为同时检测猪源临床样本中的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV),基于这两种病毒的5'UTR序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种检测CSFV和BVDV的双重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、最低检出限和重复性等进行了评价。结果显示,该方法只对CSFV和BVDV呈现特异性扩增,对猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,对阳性标准对照CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA,最低可分别检出27、36和32拷贝/μL。该方法的组内和组间试验Ct值变异系数介于0.11%~1.20%,具有良好的重现性。对152份猪组织样本用该方法进行CSFV和BVDV核酸检测,结果检出CSFV阳性样本16份,BVDV阳性样本3份,CSFV和BVDV双阳性样本1份,与国标和OIE《陆生动物诊断试验和疫苗》相应的荧光RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重荧光RT-PCR方法可用于临床样本中的CSFV和BVDV检测,从而为猪瘟防制和净化提供了一种有效的技术手段。