摘要：为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明:本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。

摘要：牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)是引起牛发生繁殖障碍性传染病的主要病原。本研究根据BVDV的5′-UTR、IBRV的gB基因和AKAV的S基因设计了3对特异性引物,构建了检测BVDV、IBRV和AKAV的多重PCR方法,并优化反应体系和条件,验证了该方法的特异性和敏感性。结果显示,构建的多重PCR方法对其他牛源病毒无扩增,对BVDV、IBRV和AKAV的最低检测限分别为10^(3)、10^(3)和10^(4)拷贝/μL。对采集的184份临床血清样品进行检测,BVDV、IBRV和AKAV的阳性率分别为18.48%、14.13%和1.63%,BVDV和IBRV 2种病原混合感染的阳性率为3.8%,BVDV和AKAV两种病原混合感染的阳性率为1.63%。该结果与我国出入境检疫行业标准符合率达92%以上,BVDV+IBRV和BVDV+AKAV混合感染的符合率为100%。表明本研究建立的多重PCR检测方法可用于临床样品的检测。BVDV、IBRV和AKAV多重PCR检测方法的建立,为我国牛群BVD、IBR和AKA的检测和流行病学调查提供了一种快捷简便的分子生物学检测方法。

摘要：旨在建立一种高效、快速、准确的检测产气荚膜梭菌并分型的多重PCR方法。根据GenBank上公布的产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素的基因序列,设计、合成4对针对4种毒素的特异性引物。并通过改变引物浓度、退火温度等反应条件,对多重PCR方法进行优化。结果显示,对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素基因均扩增出了预期大小的目的条带,而金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、停乳链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌均未出现条带;当核酸质量浓度降至12.5μg/L时,仍可清晰地扩增出α、β、ε、ι毒素基因对应条带。在核酸质量浓度降至3.12μg/L时,仍可观察到α与ε毒素基因扩增出的条带。在核酸质量浓度降至0.78μg/L时,α毒素基因对应的条带仍可隐约可见。应用该方法对68份疑似产气荚膜梭菌导致猝死的牛鼻拭子样进行检测,其中有52份样品检测结果显示为C型产气荚膜梭菌,剩余16份样品均为非产气荚膜梭菌,阳性率为76%。结果表明,本研究建立的多重PCR方法特异性强、灵敏度高重复性好,可准确地鉴别区分5种类型的产气荚膜梭菌。在采样时仅需采取疑似病畜的鼻拭子,操作简便、快捷、安全。对临床检测病畜的产气荚膜梭菌病有较为重要的意义。

摘要：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)是栖息于牛呼吸道的2种常见细菌,可引发牛的呼吸道疾病,对养殖业产生一定经济损失。为提高这2种细菌所导致疾病的临床诊断效率,本研究根据Pm的Kmt1基因、Mh的Lkt基因序列分别设计了特异性引物,建立了一种同时检测2种细菌的双重PCR检测方法。结果显示,建立的双重PCR方法对其他牛源细菌及病毒检测结果均为阴性,Pm、Mh病原基因组DNA的检测下限分别为1.57×10~5,1.98×10~6 copies/μL,表明该方法具有较好的特异性和敏感性。应用此双重PCR方法对宁夏地区118份临床样品进行了检测,结果显示Pm的检出率为57.63%(68/118),Mh的检出率为30.51%(36/118),混合感染检出率为24.58%(29/118),而且双重PCR检测结果与单一PCR检测结果一致,表明该方法可用于临床检测。Pm和Mh 2种病原双重PCR检测方法的建立,为牛呼吸道疾病的临床诊断提供了一种方便、快捷和准确的检测手段,具有一定的临床应用价值。

摘要：为了同时检测奶牛乳房炎中的6种主要致病菌,本试验分别针对金黄色葡萄球菌的nuc基因、无乳链球菌的ef-tu基因、绿脓杆菌的eta基因、停乳链球菌的16srRNA基因、致病性大肠杆菌的Phoa基因、牛支原体的opp D/F基因设计合成了6对特异性引物。在建立并验证单一PCR的基础上,构建多重PCR反应体系,对其反应体系进行优化,验证了该方法的特异性和敏感性。结果表明,该6重PCR检测方法对奶牛乳房炎的其他病原菌没有特异性扩增,对牛支原体、致病性大肠杆菌、停乳链球菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌最低检出终浓度分别为1.1×10^(5)、1.41×10^(6)、1.6×10^(3)、3×10^(5)、3.8×10^(4)和7.3×10^(3)拷贝/μL。对采集的宁夏地区98份临床乳房炎病例乳样的检测结果显示:牛支原体、致病性大肠杆菌、停乳链球菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的检出率分别为10.2%(10/98)、14.2%(14/98)、14.2%(14/98)、12.2%(12/98)、18.3%(18/98)、18.3%(18/98)。本研究建立的多重PCR检测方法具有良好的特异性及敏感性,可用于奶牛乳房炎6种主要致病菌的检测及流行病学调查。

摘要：来自牛疱疹病毒1和5型(BoHV-1和BoHV-5)的病毒囊膜糖蛋白D(gD)是病毒的主要组成成分,并且在疱疹病毒的致病机理中起到关键作用。gD对于病毒侵入细胞是必不可少的,是病毒感染细胞期间中和抗体的主要靶标。鉴于其在诱导保护性免疫方面的作用,已使用该糖蛋白作为主要抗原开发出亚单位疫苗、DNA疫苗和载体疫苗候选物,证明gD具有在宿主中诱导较强病毒中和抗体和细胞介导的免疫应答以及对宿主进行免疫保护的能力。论文着重介绍了BoHV-1、BoHV-5和一些人类疱疹病毒gD的结构和功能特征,阐述了gD与宿主免疫系统的反应及gD在新型疫苗设计中的应用,为全面了解gD结构特点及其在疫苗研发中的作用提供借鉴。