摘要：为了解牛诺如病毒(BNo V)、牛嵴病毒(BKV)和牛环曲病毒(BTo V)在国内的流行情况,本研究参考Gen Bank中登录的BNo V Rd Rp基因、BKV 3D基因和BTo V N基因保守区域,设计3对特异性引物,成功建立了能够同时快速检测BNo V、BKV、BTo V的三重RT-PCR方法。该方法特异性较强,仅对BNo V、BKV、BTo V扩增出特异性条带,对其他5种常见引发犊牛腹泻的病毒均未扩增出条带;敏感性较高,针对p MD18-T-BNo V、p MD18-T-BKV和p MD18-T-BTo V质粒标准品的最低检测限分别为2.73×10^(4)copies/μL、2.87×10^(4)copies/μL、3.18×10^(3)copies/μL;重复性好,同批次样品的3次检测结果均一致。使用该方法对153份临床样品进行检测,结果显示,BNo V、BKV、BToV的阳性率分别为11.11%、25.49%、38.56%,3种病毒混合感染率为7.18%。与其他学者建立的单一RT-PCR检测方法相比,符合率分别为94.77%、93.46%、91.50%。上述结果表明,本试验建立的三重RT-PCR方法为犊牛上述国内新发病毒快速检测及流行病学调查提供了技术支撑。

摘要：目的基于重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法分别以多房棘球绦虫(GenBank登录号:NC 000928)、细粒棘球绦虫(GenBank登录号:NC044548)和石渠棘球绦虫(GenBank登录号:NC009460)线粒体基因组序列为靶序列,依据RAA引物设计基本原则设计、合成3对引物,并进行多重RAA扩增。分别扩增不同浓度3种棘球绦虫基因组DN A和不同浓度含3种靶基因的重组质粒,以评价多重RAA检测方法的敏感性;同时采用该方法检测3种棘球绦虫及多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫基因组DNA,以评价该方法的特异性。优化建立的多重RAA法的条件,再检测棘球蚴病病变组织样本、模拟犬粪便样本和现场狐狸粪便样本,以评价该方法的应用价值。结果所建立的多重RAA检测方法可在39℃时40 min内特异性扩增多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫线粒体基因片段,长度分别约为540、430 bp和200 bp。该多重RAA法对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA的最低检测限为2.0、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,对含多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫靶基因的重组质粒的最低检测限均可达到200拷贝/μL;该多重RAA法可以同时检测出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫单一感染和多重感染,对多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫无扩增。优化后的多重RAA法能够检测出全部棘球蚴病病变组织样本及模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品,且与单一PCR法检测结果完全一致。结论成功建立了一种可用于多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DN A快速检测的多重RAA法,特异性和敏感性均较高。

摘要：【目的】建立一种犬瘟热病毒(CDV)RT-nested PCR检测方法。【方法】根据CDV弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性、重复性实验。【结果】特异性试验表明,该方法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、DNA病毒犬细小病毒(CPV)以及正常Vero细胞中均未扩增出该条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-3稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。重复性实验表明,不同情况下的3次重复实验,结果相同。用RT-nested PCR对石河子地区疑似感染CDV的病料进行检测,结果表明,该研究建立的RT-nested PCR不仅能有效的检测CDV感染,而且能够检测不同组织的样品。【结论】建立的RT-nested PCR检测方法,适用于动物CDV的快速诊断和流行病学调查。

摘要：为获得副猪嗜血杆菌(HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物,根据GenBank发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,以HPS血清13型安徽分离株(LJ3)的基因组DNA为模板,利用PCR扩增tbpA基因,然后将其克隆至pET-SUMO载体,构建重组原核表达质粒pET-SUMO-tbpA,通过PCR鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,并进行IPTG诱导表达和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了110ku的表达产物,与预期大小的转铁结合蛋白A(TbpA)的分子质量一致。Western-blot分析表明,表达产物与HPS阳性血清能发生反应,显示表达产物具有良好的免疫活性。结果表明,成功表达的TbpA为研制HPS新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。

摘要：为建立一种敏感、特异、简便的兔出血症病毒(RHDV)检测方法,根据GenBank中公布的RHDV全基因组序列保守区域设计了2对引物,筛选了其中1对建立并优化了PCR条件,扩增产物为331bp,并基于此建立了SYBR GreenⅠ荧光染料real-time RT-PCR检测方法。通过敏感性、特异性、标准曲线建立等表明,该方法可检出101以上拷贝数的模板,只在RHDV有特异性扩增,标准曲线线性相关性好。实际应用结果显示,该方法对疑似RHDV病料检测的阳性率为74.8%,而普通RT-PCR方法检测的阳性率为65.5%。该方法的建立为开展该病的诊断、疫苗制备质控等提供了有效的技术保障。

摘要：参照Torque teno mini virus(TTMV)2型的ORF1基因序列,设计一对特异性引物,成功扩增出ORF1基因,并将其转化至表达载体pET-28a中,成功构建原核表达质粒pET28a-ORF1,并导入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,ORF1基因在大肠杆菌中获得高效表达,经Western blot检测融合蛋白具有良好的免疫原性。

摘要：为了研究单增李斯特菌新疆羊源临床分离的4b血清型菌株(简称LM90)毒力基因的变异情况,参考Genbank上收录的单增李斯特菌4b血清型菌株F2365(GeneBank登陆号AE017262)的Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因序列,分别设计引物,对LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的最大开放阅读框进行PCR扩增,回收基因序列,连接到PMD19-T载体上进行克隆,筛选阳性菌进行序列的测定,将序列提交到NCBI上(登录号分别为KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612),测序后用DNAMAN软件对序列进行分析。结果显示:LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ与F2365毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的同源性分别为98.04%、96.53%、98.20%、96.41%、98.23%,氨基酸的同源性分别为99.73%、99.83%、98.67%、99.66%、99.76%,可见单增李斯特菌新疆临床分离株LM90毒力基因Ami、Auto、InlB,InlC、InlJ序列相对稳定。

摘要：为克隆不同种隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）的半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因，分析其核苷酸与编码氨基酸序列的变异情况，根据GenBank上公布的微小隐孢子虫（C. parvum）Cryptopain-1基因序列设计合成引物，用PCR技术从不同种隐孢子虫基因组DNA中扩增Cryptopain-1基因，并将其克隆至pZeroBack/blunt载体，阳性克隆经PCR鉴定正确后测序，与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因进行序列同源性比对，并进行系统进化分析。结果显示，本研究成功从泰泽隐孢子虫（C. tyzzeri）、火鸡隐孢子虫（C. meleagridis）、兔隐孢子虫（C. cuniculus）基因组DNA中扩增出Cryptopain-1基因。与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因比较，泰泽隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、兔隐孢子虫Cryptopain-1基因核苷酸序列相似性分别为98.67%、94.53%、98.34%，演绎的氨基酸序列相似性分别为99.00%、96.51%、99.00%。研究结果为利用Cryptopain-1基因进行隐孢子虫的代谢、致病机理等研究奠定了基础。